Nature子刊：光固化絲素蛋白墨水生物3D打印

來源： EngineeringForLife

投影式光固化3D打�。―LP）是一種通過光激發(fā)，分層固化的3D打印技術(shù)，具有高分辨率、可實現(xiàn)復(fù)雜結(jié)構(gòu)精細打印的特點。與擠出式3D打印不同，DLP為無噴嘴打印，其過程不會對生物墨水中的細胞產(chǎn)生大剪切力，因此可獲得較高的細胞存活率。在DLP打印過程中，雖然可以通過調(diào)控光強、曝光時間、引發(fā)劑類型和濃度等來調(diào)節(jié)固化動力學(xué)。但是，生物材料自身特性才是DLP生物墨水可打印性的決定因素。

來自韓國哈林大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Chan Hum Park和美國威克森林醫(yī)學(xué)院的Sang Jin Lee團隊首次合成了一種光固化生物墨水材料:甲基丙烯酸縮水甘油酯改性絲素蛋白（Sil-MA）。研究發(fā)現(xiàn)，Sil-MA具有優(yōu)秀的載細胞DLP打印性能、良好的成軟骨能力及與天然軟骨相匹配的機械性能。相應(yīng)研究成果分別發(fā)表于期刊Nature Communications和Biomaterials上。

圖1. Sil-MA合成原理及其制備過程示意圖[1]。

絲素蛋白（SF）來源于蠶絲的脫膠處理，具有良好的生物相容性、可生物降解性、高拉伸強度等特點，已被用于各種生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，包括傷口敷料、人造血管、細胞培養(yǎng)等。研究團隊通過甲基丙烯酸縮水甘油酯（GMA）對SF進行甲基丙烯化改性，在SF分子上引入雙鍵。由于SF分子特殊的空間結(jié)構(gòu)，其在改性前極易形成結(jié)晶而難溶于水。由于引入額外的化學(xué)基團，SF-MA分子不易結(jié)晶，可在水中溶解，這使SF-MA可形成光固化水凝膠。

圖1. Sil-MA墨水DLP打印示意圖及不同濃度Sil-MA光固化水凝膠壓縮、拉伸性能[1]。

在進行DLP打印復(fù)雜結(jié)構(gòu)前，該團隊研究了不同濃度DLP打印Sil-MA光固化水凝膠的機械性能。研究人員發(fā)現(xiàn)當紫外光強為3.5 mW/cm2時，每一層溶液的固化時間小于3s，這有利于提高打印速率。打印水凝膠的壓縮模量隨Sil-MA濃度和應(yīng)變的增加而增加。Sil-MA濃度每增加10％，壓縮模量就會增加約2.6倍（圖1 b、c）。對于濃度30％的Sil-MA水凝膠，壓縮破壞應(yīng)力高達910 kPa，其足以支撐重達7 kg的壺鈴，并在壺鈴取下后立即恢復(fù)其原始形狀（圖1 d）。Sil-MA水凝膠水凝膠同樣具有很高的拉伸強度，濃度為30％時，其拉伸斷裂應(yīng)力可達50 kPa。Sil-MA水凝膠優(yōu)良的機械性能使其可經(jīng)受簡單的外科縫合而不撕裂（圖1 g、h）。

圖2. 30% Sil-MA多孔結(jié)構(gòu)DLP打印分辨率測試[1]

圖3. 30% Sil-MA墨水通過DLP技術(shù)打印的微孔支架及埃菲爾鐵塔模型[1]

隨后，研究人員測試了Sil-MA墨水的DLP打印分辨率及復(fù)雜結(jié)構(gòu)成型能力。從圖2孔道結(jié)構(gòu)水平和垂直方向打印測試可以看出，垂直孔道可實現(xiàn)約100μm的打印精度，水平孔道可實現(xiàn)約200 μm的打印精度。研究人員利用Sil-MA墨水分別打印了多孔三維支架和埃菲爾鐵塔模型（圖3），從實物圖可看出：孔道直徑700μm及1mm的多孔支架貫通性良好，高度5cm的埃菲爾鐵塔模型具有規(guī)整的外形。

圖4. 與GelMA相比，不同濃度Sil-MA水凝膠內(nèi)3T3成纖維細胞生長及增值情況（a、b，標尺500 μm），載細胞DLP打印不同結(jié)構(gòu)水凝膠及其內(nèi)部細胞分布圖（c~f，標尺5 mm）[1]。

以水凝膠模擬細胞外基質(zhì)三維培養(yǎng)細胞，細胞的存活及增值是評價生物墨水性能的重要指標，研究者將濃度為10、20、30%的Sil-MA與已知具有優(yōu)異生物性能的甲基丙烯酰化明膠（GelMA）作對比。實驗發(fā)現(xiàn)Sil-MA水凝膠中的細胞生長狀態(tài)良好，且濃度30%Sil-MA凝膠中細胞的增殖能力與10% GelMA對照組基本相同（圖4a、b）。

載細胞DLP打印最大的技術(shù)挑戰(zhàn)是墨水中細胞的沉降，這造成細胞無法在支架中均勻分布。在后續(xù)的載細胞打印實驗中，研究人員測試了Sil-MA不同形狀樣品及多細胞分區(qū)打印性能（圖4c~f）。從激光共聚焦掃描結(jié)果看，細胞較為均勻的分布于打印支架中，無明顯分層。圖4f展示了一個具有四層結(jié)構(gòu)、兩種顏色標記細胞的DLP打印支架。

圖5. 負載人軟骨細胞的Sil-MA水凝膠DLP打印及體外、體內(nèi)實驗過程[2]。

經(jīng)過材料合成、機械性能、打印性能、生物相容性等研究后，該團隊又進行了更深層次的體內(nèi)外生物學(xué)評價-軟骨組織工程。

圖6. 載鼠NIH 3T3成纖維細胞DLP打印Sil-MA支架縱剖面細胞分布染色圖（A，比例尺：1 mm），細胞計數(shù)統(tǒng)計（B）[2]。

研究人員將DLP打印的載有NIH 3T3成纖維細胞Sil-MA支架在體外培養(yǎng)，并在0、4、7天對支架進行切片染色觀察并進行細胞計數(shù)，結(jié)果如圖6所示。熒光照片顯示細胞在支架的上部與下部分布均勻，細胞計數(shù)顯示同樣的結(jié)果，且培養(yǎng)第7天細胞有增值的趨勢。

圖7. 兔氣管、純Gel-GMA、純Sil-MA、載軟骨細胞Sil-MA水凝膠支架在不同體外培養(yǎng)時間后的三點彎曲測試數(shù)據(jù)[2]。

為了確定人工氣管的機械強度，對體外培養(yǎng)1-2周的純GMA改性的明膠（Gel-GMA）、純Sil-MA、載軟骨細胞Sil-MA水凝膠進行三點彎曲測試，以天然兔氣管作為對照，結(jié)果如圖7所示。體外培養(yǎng)1周和2周后不含細胞的Gel-GMA水凝膠強度比天然兔氣管弱，不含細胞的Sil-MA表現(xiàn)出同樣結(jié)果。但是不含細胞Sil-MA水凝膠的強度取決于體外培養(yǎng)的時間。此外， Sil-MA水凝膠在負載細胞后表現(xiàn)出更高的強度，且隨培養(yǎng)時間增加。載細胞的Sil-MA水凝膠在體外培養(yǎng)后具有與天然兔氣管相似的強度。

圖8. 負載人軟骨細胞Sil-MA水凝膠體外培養(yǎng)后切片染色圖及硫酸糖胺多糖（sGAG）含量、相應(yīng)軟骨細胞特異性基因凝膠電泳圖[2]。

對體外培養(yǎng)的載軟骨細胞Sil-MA水凝膠進行組織切片蘇木精和曙紅（H＆E），馬森三色（MT），番紅O（SFO）和PKH67染色（圖8）。在培養(yǎng)的第一周，Sil-MA水凝膠中出即現(xiàn)了軟骨細胞結(jié)構(gòu)和形成了新軟骨，且隨著培養(yǎng)時間延長，細胞數(shù)量及生成的軟骨量持續(xù)增加。切片染色結(jié)果顯示Sil-MA水凝膠可為軟骨細胞提供良好的的生長和成軟骨環(huán)境。圖8中軟骨細胞分泌的糖胺多糖及軟骨細胞相應(yīng)基因?qū)W水平測試結(jié)果同樣表明，Sil-MA水凝膠可為軟骨基質(zhì)的生成提供有利條件。

圖9. 載軟骨細胞DLP打印支架植入兔氣管實驗圖及植入6周后的組織切片圖[2]。

最后，研究人員將DLP打印的載軟骨細胞支架體外培養(yǎng)一周后縫合到兔氣管缺損處（圖9）。初期，Sil-MA水凝膠與周圍組織不夠吻合，使腔體變窄。隨著移植期延長，周圍組織長入手術(shù)部位，使凝膠成為氣管的一部分，氣管內(nèi)徑逐漸增加。移植后第6周進行H＆E和MT染色，結(jié)果顯示在Sil-MA水凝膠內(nèi)形成了新的軟骨。此外，Sil-MA水凝膠周圍發(fā)現(xiàn)了擴展的上皮基質(zhì)。人工氣管的移植結(jié)果表明，Sil-MA水凝膠替代了氣管的缺損部分，并引導(dǎo)了氣管的再生。

參考文獻：
[1]   Kim SH, Yeon YK, Lee JM, et al. Precisely printable and biocompatible silk fibroin bioink for digital light processing 3D printing [J]. Nature Communications, 2018, 9(1): 1–14. DOI: 10.1038/s41467-018-03759-y
[2]   Hong H, Seo YB, Kim DY, et al. Digital light processing 3D printed silk fibroin hydrogel for cartilage tissue engineering [J]. Biomaterials, 2020, 232: 119679. DOI: 10.1016/j.biomaterials.2019.119679