生物3D打印帶介觀孔隙結(jié)構(gòu)的大尺寸體外組織

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水凝膠固有的致密微觀孔隙網(wǎng)絡(luò)，營(yíng)養(yǎng)/氧氣供應(yīng)能力有限，需額外引入營(yíng)養(yǎng)輸送網(wǎng)絡(luò)以提高營(yíng)養(yǎng)輸送效率，滿(mǎn)足細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的需求。目前常見(jiàn)的帶宏觀孔隙的水凝膠結(jié)構(gòu)打印，即宏觀孔隙網(wǎng)絡(luò)（≥1mm）結(jié)構(gòu)打印，由于水凝膠強(qiáng)度比較低，打印大孔隙結(jié)構(gòu)時(shí)宏觀多孔結(jié)構(gòu)易坍塌，導(dǎo)致大尺寸組織打印后內(nèi)部營(yíng)養(yǎng)不良。本研究中，我們繼續(xù)推進(jìn)大尺寸組織的體外構(gòu)建，提出在水凝膠材料內(nèi)構(gòu)造介觀尺度孔隙概念，孔隙范圍100 μm-1 mm，介觀孔隙可同時(shí)發(fā)揮營(yíng)養(yǎng)/氧氣供應(yīng)和強(qiáng)度支撐作用，能兼顧生物性能和可打印性的要求（圖1）。

圖1A) 多尺度孔隙在組織工程中的功能 B) 目前采用的致密水凝膠網(wǎng)絡(luò)用于結(jié)構(gòu)支撐；期望的是兼顧結(jié)構(gòu)支撐和營(yíng)養(yǎng)輸送的介觀尺度孔隙網(wǎng)絡(luò)

我們?cè)O(shè)計(jì)了載犧牲微明膠生物墨水，實(shí)現(xiàn)了介觀孔隙網(wǎng)絡(luò)活性結(jié)構(gòu)的高效打印。結(jié)構(gòu)具有高保真度的同時(shí)，保持了較高的生物活性，細(xì)胞可在介觀孔隙網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)內(nèi)發(fā)生類(lèi)體內(nèi)生長(zhǎng)行為，如伸展、遷移、連接及組織新生等。

載犧牲微明膠生物墨水具體制備過(guò)程分三步（圖2），i)將明膠溶液通過(guò)低溫冷卻完全凝膠化；ii) 通過(guò)打印用的噴頭，將低溫凝膠化的明膠平穩(wěn)勻速的擠碎成微明膠顆粒，擠碎的同時(shí)直接擠至載有相應(yīng)細(xì)胞的GelMA生物墨水，隨后混合均勻；iii)將載有犧牲微明膠和細(xì)胞的GelMA生物墨水裝入打印用的注射器，并冷卻成可打印的預(yù)凝膠化生物墨水。值得注意的是，在冷卻制備可打印的預(yù)凝膠化生物墨水過(guò)程中，裝墨水的注射器要每隔20秒翻轉(zhuǎn)一次，以確保細(xì)胞和犧牲微明膠混合均勻。

圖2 載微明膠GelMA預(yù)凝膠化生物墨水制備過(guò)程

利用載犧牲微明膠生物墨水，可實(shí)現(xiàn)介孔營(yíng)養(yǎng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)打�。▓D3）。

圖3 打印的介觀孔隙網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)

通過(guò)調(diào)整不同擠出噴頭制備不同尺寸的微明膠，可以實(shí)現(xiàn)具有不同尺寸孔隙結(jié)構(gòu)的打印。此外，調(diào)整預(yù)凝膠生物墨水中的微明膠比例，可以實(shí)現(xiàn)不同孔隙率結(jié)構(gòu)打印。（圖4）

圖4 不同孔隙尺寸，不同孔隙率結(jié)構(gòu)的打印

此外，由于犧牲微明膠和GelMA相互協(xié)同工作，增強(qiáng)了整個(gè)生物墨水體系的可打印性，能夠容易的實(shí)現(xiàn)復(fù)雜結(jié)構(gòu)的打印，圖5,6所示。

圖5 二維復(fù)雜介觀孔隙網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)打印

圖6 三維復(fù)雜介觀孔隙網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)打印

為了模擬生物體內(nèi)細(xì)胞或細(xì)胞外基質(zhì)組成多樣性，我們還模擬制造了多細(xì)胞或多材料組織結(jié)構(gòu)。如圖7所示，采用多合一噴頭裝置，可以切換多種載細(xì)胞材料進(jìn)行打印。打印時(shí)，選擇性的通入目標(biāo)載細(xì)胞材料，可以打印出多組分介觀孔隙網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

圖7 多組分介觀孔隙網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)打印

為了驗(yàn)證介觀孔隙網(wǎng)絡(luò)能有效的傳輸營(yíng)養(yǎng)/氧氣，促進(jìn)細(xì)胞存活及組織的再生，我們打印了載細(xì)胞的介觀孔隙網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)(10 mm × 10 mm × 10 mm)，并觀察結(jié)構(gòu)體內(nèi)的細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，如圖8所示，細(xì)胞在介觀孔隙網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)內(nèi)逐漸伸展、遷移并連接，驗(yàn)證了介觀孔隙網(wǎng)絡(luò)傳輸營(yíng)養(yǎng)/氧氣的有效性。

圖8 細(xì)胞在多孔結(jié)構(gòu)內(nèi)自由伸展、遷移、連接形成活性組織結(jié)構(gòu)體

利用載犧牲微明膠生物墨水，直接打印高生物活性介觀孔隙網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，能有效的促進(jìn)細(xì)胞存活及活性組織形成。犧牲微凝膠可通過(guò)自適應(yīng)的制造方式制備，微凝膠尺寸高度可控，打印時(shí)不會(huì)堵塞噴頭，同時(shí)打印結(jié)構(gòu)的孔隙尺寸、孔隙率等均可控。同時(shí)，由于犧牲微凝膠與載細(xì)胞墨水協(xié)同相互作用，增強(qiáng)了整個(gè)墨水體系的可打印性，利于結(jié)構(gòu)的高效打印。此外，我們?cè)O(shè)計(jì)的多合一噴頭用于打印多材料異質(zhì)結(jié)構(gòu)，使復(fù)雜異質(zhì)組織結(jié)構(gòu)的制造成為可能。

相關(guān)論文“Sacrificial microgel‑laden bioink‑enabled 3Dbioprinting of mesoscale pore networks”近日刊登在Bio-Design and Manufacturing雜志上。第一作者為邵磊博士生，通訊作者為賀永教授，浙二醫(yī)院的劉震杰醫(yī)生，高慶博士為共同通訊。

論文鏈接：
https://doi.org/10.1007/s42242-020-00062-y