干貨： 全球細胞3D打印技術綜述

南極熊導讀：本文是由一個生物3D打印領域的博士所寫的干貨文章，對全球的細胞3D打印技術進行了綜述，已于2019年1月發(fā)布在《新材料產(chǎn)業(yè)》上。
作者：趙  雨     上普博源(北京)生物科技有限公司

目前，英國有 5 000多人在等待移植新的腎臟。在接下來的一年里，經(jīng)過 平均大約 30個月的等待后，他們中只 有不到一半的人會得到新的腎臟。其 余的人將繼續(xù)等待，可他們不能永遠 堅持下去:2016年，457名英國人在等 待新腎、新肝、新心臟或新肺的過程中 死亡。另有 875人由于已經(jīng)病得無法 接受移植手術而從候補名單上被除 名。而在中國這種情況更為嚴重，據(jù) 統(tǒng)計，中國的人體器官的供需比僅為 1∶ 30，與英美發(fā)達國家的 1∶ 3左右 的供需比相差甚遠。在數(shù)以萬計的等 待者中，每年僅有幾千名幸運兒可以 接受器官移植。

南極熊配圖：艾伯爾生物3D打印技術

1 生物3D打印技術簡介
如果科學家們不再依賴稀缺的捐 贈器官，而是能夠在實驗室中快速、廉 價地構建健康的新器官，并將患者自 身的細胞作為原材料，那會怎樣?在 過去的約 15年里，這個夢想推動了在 生物 3D打印領域的投資和研究。生物 3D打印技術是將生物單元(細胞/蛋 白質(zhì)/ D N A等)和生物材料按仿生形 態(tài)學，生物結構或生物體功能，細胞 特定微環(huán)境等要求用“三維打印”的技 術手段制造出具有個性化的體外三維 結構模型或三維生物功能結構體。其科學研究、技術應用和產(chǎn)業(yè)化發(fā)展廣 涵于生物 3D打印裝備和生物墨水的 研發(fā)及制造、高端醫(yī)療器械的制造、復 雜組織工程支架制造、體外生物功能 結構體的制造、生物/病理/藥理模型 和新藥檢測模型制造等。

生物 3D打印作為一門新興交叉 前沿技術領域，目前在國內(nèi)外得到前 所未有的戰(zhàn)略關注， 如美國增材生 物制造探討，歐盟《制造業(yè)的未來 : 2015 ~2020戰(zhàn) 略 報 告》、“十 三 五”規(guī) 劃綱要、國家科學技術部/工業(yè)和信 息化部 3D打印戰(zhàn)略規(guī)劃等均將以細 胞和先進生物材料為基礎的生物制造 和生物 3D打印技術視為國家重要戰(zhàn) 略發(fā)展方向。

2 生物 3D 打印技術的應用
根據(jù)所用生物材料性能的不 同，清華大學生物 3D打印中心將目前 生物 3D打印技術分為 4個層次。
△南極熊配圖：細胞3D打印應用，圖片來自上普博源

第 1層次是打印無生物相容性要求的材料，可應用于 3D打印體外病例 模 型 、手 術 導 板 、3 D 打 印 體 外 假 肢 或 矯形輔具等領域，該層次的應用極大 地發(fā)揮了 3D打印在個性化定制方面 的優(yōu)勢，幫助相關病人量身定做相關 手術模型或治療工具，可使病人得到 更好的治療。

第 2層次是打印具有生物相容 性，但非降解材料。此類打印產(chǎn)品可以 作為體內(nèi)永久植入物，材料可以是鈦 合金等金屬等材料，也可以是高分子 等惰性材料等，其中 3D打印金屬植入 物廠商愛康醫(yī)療已獲得多個C F D A上 市許可證書，產(chǎn)品已應用于臨床。

第 3層次是打印具有良好生物相 容性且可降解的生物材料，主要的應 用領域為打印組織工程支架。其要求 打印的體內(nèi)植入物不僅能與體內(nèi)相 容，還要具有降解特性，在體內(nèi)一定 時間促進體內(nèi)缺損組織的生長和愈 合。由清華大學生物制造中心獨創(chuàng)的 3D打印低溫沉積制造技術集成了生 物 3D打印與冷凍干燥微觀制孔技術 的優(yōu)勢，可實現(xiàn)同時具有宏觀可控孔 隙(百微米級)與微觀微絲孔隙(十微 米級)的組織工程支架的 3D打印，提 高了支架內(nèi)的細胞種植率，更利于細 胞在支架內(nèi)部的生長和組織功能的實 現(xiàn)，并在骨組織工程支架等領域應用 良好，并已開始向臨床轉化。

第 4層次是打印活性細胞，蛋白 及其他生物活性分子等，該層次的生 物 3D打印技術也被稱作細胞 3D打印 技術。細胞 3D打印技術可以直接將細 胞、蛋白及其他具有生物活性的材料(例如蛋白質(zhì)，D N A，生長因子等)作為 3D打印的基本單元，以 3D打印的方式，直接構建體外生物結構體、組織 或器官模型。


△南極熊配圖



3 細胞3D打印的技術挑戰(zhàn)
細胞 3D打印技術是目前生物 3D 打印技術的最前沿技術，也是實現(xiàn)器 官打印的最大潛在技術。打印過程 中，細胞必將承受一定的機械力，甚至 造成一定損傷，因此，細胞 3D打印技術的實現(xiàn)充滿了各種技術挑戰(zhàn)，細胞3D打印的技術挑戰(zhàn)主要包括以下幾 個方面。

3.1 材料能否打印
首先要選擇能被生物 3D打印機 打印的生物材料/生物墨水，雖然不 同的打印工藝對生物墨水粘度有不 同要求，但總體來講，太低粘度或太 高粘度的生物墨水，都很難被打印。因 此，細胞 3D打印的第一個挑戰(zhàn)是要找 到可以被打印的生物墨水。
3.2 能否構建3D結構
并不是所有被打印的生物墨水都 可以構建 3D結構，為了打印出具有高 分辨率的 3D復雜細胞結構體，細胞打 印墨水需滿足通過提高打印墨水的粘 度來提高生物墨水的凝膠能力，以維 持層層堆積結構體的力學性能。

3.3 細胞能否存活
增加細胞打印墨水的粘度，會導 致打印過程中細胞打印墨水中的細胞所承受的剪切力增加，從而導致打印 后細胞存活率的下降。因此，控制好打 印過程中細胞打印墨水的粘度(既不 能太高也不能太低)，尋找細胞打印墨 水的合適粘彈性區(qū)間，是實現(xiàn)良好細 胞三維打印(良好的成形性能與生物 學性能)的重要步驟。

3.4 是否具有功能性
剛打印的 3D細胞結構體，只是細 胞和生物材料的 3D組合體，并沒有形 成組織特征。因此，打印的 3D細胞結 構體，必須經(jīng)過適宜的培養(yǎng)條件，才能 形成組織功能性。此環(huán)節(jié)需要保證，生 物材料的生物相容性，力學性能和功 能性，培養(yǎng)基的充足供應和廢物的充 分排出等。甚至有些組織需要特定的 生物反應器，通過流體，力或電的刺激 才能達到其功能性。

綜上所述，細胞 3D打印的各個環(huán) 節(jié)充滿了不同甚至具有一定相互矛盾 的技術挑戰(zhàn)，需要多學科的交叉背景 知識和多年的經(jīng)驗積累去解決。

4 細胞 3D 打印技術分類
其根據(jù)其離散細胞墨水的方法主要可以分為 5類(表 1)。

4.1 噴墨式細胞打印技術
噴墨式細胞打印是基于普通噴 墨打印機的打印原理，利用熱氣泡或 壓電的體積變化，擠壓墨盒內(nèi)的細胞 墨水，離散產(chǎn)生含有細胞的細胞墨水的微滴并噴射出去。噴墨打印機的 噴嘴直徑僅有幾十微米，可以進行高 精度的細胞打印，但是也由于其噴嘴 直徑比較小，噴墨式細胞打印難以離 散打印高粘度的細胞墨水，使得此技 術直接打印三維生物學實體模型較困 難 ;此外，熱氣泡的產(chǎn)生和壓電的變 形會對細胞造成一定損傷，需較好的 控制打印工藝參數(shù)。代表性研究機構 有德州大學的Boland教授課題組。

4.2 微擠出式細胞三維打印技術
微擠出式細胞三維打印技術，利 用機械力或氣壓等驅(qū)動力，直接通過微 噴頭連續(xù)擠出生物材料和細胞構建三 維生物學結構體。由于常用的微擠 出式細胞打印機的噴嘴直徑多在百微 米級，打印精度一般，但其擠出式的工 藝可以打印高粘彈性的生物墨水，易于 實現(xiàn)三維生物學實體的構建。此外，此 技術在犧牲精度的同時，使得打印出的 每一個離散單元體積變大，間接地提高 了打印效率和細胞存活率。代表的研究 機構有清華大學生物制造中心的孫偉 教 授 課 題 組 ，美 國 哈 佛 大 學 的 J e n n i f e r Lewis教授課題組。

4.3 激光直寫式細胞打印技術
激光直寫式細胞打印技術，是指 利用光壓力控制細胞排列成具有高 精度的空間結構，其精度可達單細胞 量級，但提高的精度也導致成形效率 下降明顯，該工藝也難以打印粘度較高的生物材料，使得其打印三維生物 學結構體的能力降低。代表的研究 機構有美國明尼蘇達大學的David Odde教授課題組。

4.4 立體光刻細胞三維打印技術
立體光刻細胞三維打印技術，通過 激光或紫外光在空間的掃描運動實現(xiàn)對 含有細胞的光刻膠的立體固化成形，制 造出預設計的三維生物學結構。雖 然 這種技術具有高度的柔性，但其成型 效率卻不如人意。部分開發(fā)者不再利 用激光細小的光斑掃描立體固化成 形，而是利用投影機原理，進行面投 射，每層同時固化成形。該工藝根據(jù)投 影機類型主要可以分為液晶投影儀 型和數(shù)字微鏡(Digital Micromirror D e v i c e s , D M D )投 影 儀 型 ，兩 者 的 本 質(zhì)區(qū)別是液晶投影儀首先將光源分解 成 3種單色光，再分別通過 3個液晶片 控制 3種單色光的亮度，最終合成所 需的光和圖案，而D M D只是利用一個 可以反射光源的數(shù)字陣列式微鏡來實 現(xiàn)。該種工藝的光敏水凝膠預先存儲 在成形室內(nèi)，會造成材料浪費，以及難 以制造多種細胞的異質(zhì)結構，且光敏 水凝膠多具有不同程度的毒性，使得 該種工藝的細胞存活率一般。代表的 研究機構有美國加州大學圣地亞哥分 校的Chen Shaochen課題組。

4.5 聲波驅(qū)動式細胞打印技術
聲波驅(qū)動式細胞打印技術是利用 聲波的振動產(chǎn)生微滴噴射的方法，其 精度最小可達 10μ m左右，但該工藝 也是微滴噴射的方法，難以噴射高 粘度的生物材料，使得打印三維生 物學結構體的能力受到限制。代表 的研究機構有美國Stanford大學的 Demirci教授課題組。
綜上所述，各種細胞打印方法各 有所長，但對于具有三維復雜異質(zhì)生

物學結構體來說，微擠出式細胞三維 打印技術更為合適，其構建多細胞三 維模型更容易，效率更高，細胞存活 率高，打印精度(百微米級)也能滿足 一般科研使用需求。所以，目前市場 上主流的細胞 3D打印機多是基于該 技術實現(xiàn)，代表公司有德國Envision TEC公司、瑞士Regen Hu公司，國內(nèi) 的上普博源(北京)生物科技有限公司(SunP Biotech)、捷諾飛生物科技股 份有限公司等。

5 細胞 3D 打印的生物墨水分類
微擠出式細胞三維打印的生物 墨水有很多種，根據(jù)其溶膠-凝膠固 化轉變原理可以分為以下幾種方式( 表 2 )。

5.1 溫敏水凝膠生物墨水
溫敏水凝膠生物墨水可以通過 環(huán)境溫度的改變實現(xiàn)其溶膠-凝膠 方式的轉變。凝膠-溶膠轉變溫度在 0 ~37°C之間且生物相容性好的水 凝膠材料均有能力作為細胞打印墨 水。最具代表性的溫敏水凝膠細胞 打印墨水為明膠。溫敏水凝膠的溶膠 到凝膠的轉變方式一般為可逆的，且 只要材料溫度達到轉變溫度即可轉 變，無需使用液體交聯(lián)劑，不受交聯(lián)劑 滲透深度影響，也不易出現(xiàn)液體交聯(lián) 劑導致三維打印離散層層堆積時，層 與層之間出現(xiàn)的層間剝離現(xiàn)象，易于 構建大尺寸的三維細胞結構體。

5.2 離子交聯(lián)式生物墨水
以海藻酸鈉為代表的水凝膠材 料，可以通過與離子溶液相接觸的方 式進行交聯(lián)固化，實現(xiàn)溶膠-凝膠方 式的轉變。但是此種離子置換的交聯(lián) 方式反應很快，難以利用生物墨水與 交聯(lián)劑預混合的方式打印，一般只能 利用含離子的液體進行浸泡或噴射在 生物墨水表面進行交聯(lián)。但細胞三維 打印機若使用液體浸泡的方式進行 交聯(lián)，易出現(xiàn)前文提到的層間剝離現(xiàn) 象，不利于打印三維生物學結構體。

5.3 酶促交聯(lián)式生物墨水
以纖維蛋白原為代表的水凝 膠材料，可以通過與生物酶相接觸的 方式進行交聯(lián)，實現(xiàn)溶膠-凝膠方式 的轉變。此種酶促交聯(lián)方式一般反應 較慢，生物酶可以混入液體制成交聯(lián) 劑，通過液體浸泡的方式進行交聯(lián)，也 可以與水凝膠生物墨水預混合后，待 時間孵育交聯(lián)。但溶膠到凝膠轉變反 應慢，也增加了成形難度，不易于直接 打印三維結構體。

5.4 紫外光固化
部分合水凝膠材料經(jīng)過合成改 性，再加入光引發(fā)劑，使得水凝膠生物 墨水具有光敏特性，可以通過紫外光 進行交聯(lián)固化(例如G e l M A 等)。光 敏水凝膠一般強度高，紫外光的滲透 深度比一般液體交聯(lián)劑的滲透深度更 深，但光引發(fā)劑的引入，會降低生物墨 水的生物活性。

6 細胞3D打印的未來
盡管目前細胞 3D打印已能打印 多種細胞，甚至可以構建一些簡單的 組織等，但其距離器官打印還有一段 距離，未來值得關注一下幾方面的研 究突破或趨勢變化，以促進細胞 3D打 印技術的向前發(fā)展。

6.1 研究新型生物墨水
目前，尚不存在理想型的生物墨 水。基于天然生物材料的墨水生物相 容性好，但大多難以打印或力學性能 不好�；�于人工合成高分子材料的墨 水打印性能或力學性能較好，但生物 活性一般較差，甚至有些材料沒有經(jīng) 過F D A認證。未來，研發(fā)打印性能和 生物學性能兼優(yōu)的生物墨水將是行業(yè) 不可避免的趨勢。

6.2 產(chǎn)業(yè)化促進整個領域快速向前
隨著生物 3D打印產(chǎn)業(yè)化的不斷 成熟，越來越多的廠商開始開發(fā)商業(yè) 化的生物 3D打印機，生物 3D打印機 的功能越來越強大，價格越來越低 廉。這使得新進入這個交叉領域的研 究者，尤其是材料學家，生物學家，醫(yī) 生等非機械電子專業(yè)的研究者，可以 無需花精力在自己不擅長的打印機開 發(fā)領域，而專注于生物墨水的研發(fā)及 組織或器官的構建研究。因此，細胞 3D打印機的產(chǎn)業(yè)化正在促進這個領 域更快的發(fā)展。

6.3 提供細胞 3D 打印的專業(yè)化 服務將是未來的趨勢
細胞 3D打印的交叉學科特性及 技術挑戰(zhàn)，決定了其入門具有一定的門檻。因此，通過與有經(jīng)驗的科研機 構合作，或?qū)ふ矣薪?jīng)驗的公司進行技 術服務，將是此領域新入門者快速 獲取知識并取得科研成果的便捷途 徑。據(jù)此預測，具有高校研究背景的 細胞 3D打印的專業(yè)化服務公司將會 越來越多。

7 結語
近年，細胞 3D打印技術隨著生物 3D打印機和生物墨水的產(chǎn)業(yè)化已走 進越來越多的實驗室，更多的交叉領 域研究者一起投身到這個實現(xiàn)人類器 官再造夢想的領域。相信隨著細胞 3D 打印領域的不斷蓬勃發(fā)展，實現(xiàn)器官 打印的那天也不會太遙遠。

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作者：趙  雨     上普博源(北京)生物科技有限公司

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