南京大學(xué)鼓樓醫(yī)院關(guān)節(jié)外科史東泉：控制Kartogenin透明質(zhì)酸凝膠修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨的研究

丁建東：非常感謝徐教授！徐教授的每次報(bào)告，總是既哲理又詩(shī)情畫意。后面一個(gè)，本來(lái)是蔣青教授，現(xiàn)在由史東泉教授來(lái)作。蔣教授是鼓樓醫(yī)院關(guān)節(jié)外科的主任，史教授是副主任。史教授國(guó)家優(yōu)秀青年基金獲得者，我相信他在一線也工作若干年，肯定會(huì)有自己的見(jiàn)地，下面歡迎史教授給我們作報(bào)告！

南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院關(guān)節(jié)外科副主任 史東泉的《控制Kartogenin透明質(zhì)酸凝膠修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨的研究》

    史東泉：尊敬的戴院士，謝謝主持人丁老師！
    我們也瞎做了一些東西，但是未來(lái)也許可能不是白做的，我覺(jué)得我們也在談一些轉(zhuǎn)化的事。
    作為一個(gè)關(guān)節(jié)外科大夫，大家知道我們整天就知道換關(guān)節(jié)。其實(shí)我們平時(shí)也想砸砸自己的飯碗，所以我們也想把軟骨修復(fù)修復(fù)。所以我們進(jìn)行了軟骨修復(fù)做了一些工作，跟大家匯報(bào)一下。
    從臨床上來(lái)講，軟骨實(shí)際上真的非常糟糕。我們做過(guò)大量的流調(diào)，就是在一個(gè)小區(qū)里面60歲里面，問(wèn)問(wèn)他有沒(méi)有膝關(guān)節(jié)不舒服，60%以上的人都有這樣的體驗(yàn)，覺(jué)得我確實(shí)很久沒(méi)有蹲下去了。這樣的問(wèn)題，最終主要的問(wèn)題出現(xiàn)在軟骨上來(lái)。很明顯的，這是我們?cè)谥脫Q膝關(guān)節(jié)，但是白色軟骨四周都磨沒(méi)了，我們可以看到他的軟骨下骨。但是我們想想國(guó)內(nèi)有將近八千萬(wàn)的患者，需要去塑造這樣的軟骨。
    目前來(lái)講，其實(shí)從臨床上來(lái)講，我們有很多的方法。我們可以看一下，我們想做軟骨再生的時(shí)候，我們發(fā)現(xiàn)這樣的病人有大量的有局灶性軟骨缺損，當(dāng)然還有一些年輕人的彌漫性的軟骨缺損。現(xiàn)在有很多問(wèn)題，包括種子細(xì)胞、一體化、軟骨表型的問(wèn)題，始終沒(méi)有一個(gè)功能性的軟骨。上午很多老師講了他們的研究，其實(shí)作為臨床大夫來(lái)講，我們是希望策略越簡(jiǎn)單越好，而不是說(shuō)越復(fù)雜越好，因?yàn)樵綇?fù)雜就越難開(kāi)展。
    我們每天早上7點(diǎn)點(diǎn)8點(diǎn)鐘都有討論，這樣的小分子有機(jī)化合物就是他們討論的東西。我們?cè)?012年發(fā)現(xiàn)，這個(gè)小分子對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有明顯的向軟骨方向分化的作用。對(duì)于我們做軟骨的人來(lái)講特別敏感，一聽(tīng)到有這樣的軟骨有什么樣的作用，我們會(huì)再繼續(xù)探索。在2014年的時(shí)候，發(fā)現(xiàn)有人把小分子分開(kāi)，發(fā)現(xiàn)對(duì)滑膜關(guān)節(jié)的軟骨發(fā)育有很好的促進(jìn)作用。我們?cè)龠M(jìn)一步探究它的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)這樣的小分子有機(jī)物跟我們軟骨相關(guān)的分子有強(qiáng)烈的相關(guān)性。在這里，我們就在想能不能建立緩釋組織工程支架體系，從而獲得與天然軟骨相接近的材料？
    對(duì)于這樣的課題，大家一起坐下來(lái)談，想要解決哪些問(wèn)題？第一個(gè)，我們作為古柯關(guān)節(jié)大夫來(lái)講，我們發(fā)現(xiàn)膝關(guān)節(jié)里面更多是滑膜，滑膜里面用大量的間充質(zhì)干細(xì)胞。既然告訴我們這樣的小分子有機(jī)物對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有成軟骨作用。那整個(gè)課題告訴，滑膜類型的間充質(zhì)干細(xì)胞作為成軟骨種子細(xì)胞，以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞更有優(yōu)勢(shì)。而且很多臨床上的疾病，當(dāng)時(shí)生出來(lái)這樣的組織，跟軟骨有很相似的外形形狀。如果它對(duì)滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞有成軟骨作用，我們就去探索到底什么樣的濃度是最佳的。如果我們找到這樣的濃度，那我們是不是拿到往關(guān)節(jié)內(nèi)去打。如果關(guān)節(jié)內(nèi)打打，我們發(fā)現(xiàn)能不能在臨床上盡量去運(yùn)用它？這一系列的關(guān)鍵問(wèn)題，就造成了這樣的課題，我們希望通過(guò)我們的研究，把這樣的幾個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題解決掉。
    于是我們開(kāi)始了研究?jī)?nèi)容的設(shè)計(jì)。我們希望把滑膜和間充質(zhì)干細(xì)胞分離出來(lái)，我們希望它也有軟骨作用，進(jìn)一步想往天然軟骨方向轉(zhuǎn)化。
    那么我們就開(kāi)始了我們第一步，我們把膝關(guān)節(jié)的滑膜取下來(lái)，取下來(lái)以后進(jìn)行培養(yǎng)。我們發(fā)現(xiàn)到8個(gè)月以后，我們特別興奮地發(fā)現(xiàn)得到了這樣一個(gè)組織，我們只是做了一個(gè)離心的培養(yǎng)。當(dāng)時(shí)，我們看到這樣的組織以后挺興奮的，因?yàn)楦�我們手上看�?jiàn)的軟骨已經(jīng)漸漸相似了。我們做了KGN，我們發(fā)現(xiàn)這樣一個(gè)類軟骨的組織，我們發(fā)現(xiàn)在這個(gè)軟骨里面有大量類軟骨的細(xì)胞，有組織的形成。我們當(dāng)時(shí)就在想，這樣一個(gè)類軟骨組織到底是纖維軟骨還是透明軟骨？因?yàn)樘烊魂P(guān)節(jié)內(nèi)是透明軟骨。當(dāng)然如果我們經(jīng)常不去手術(shù)，慢慢它轉(zhuǎn)成纖維軟骨。
    做軟骨都知道II型膠原是天然軟骨的關(guān)鍵，所以我們就去做了這樣一個(gè)熒光，我們發(fā)現(xiàn)這樣一個(gè)類軟骨組織里面，有大朗的II型膠原的表達(dá)。再比如我們的類天然的組織，很有可能跟天然透明軟骨相近。于是我們又做了現(xiàn)到4個(gè)禮，發(fā)現(xiàn)加入這個(gè)小分子有機(jī)物這個(gè)組里面的II型號(hào)膠原表達(dá)特別強(qiáng)烈。我們又檢測(cè)纖維軟骨透明性的表達(dá)，的時(shí)候，跟對(duì)照?qǐng)D比有明顯的縮小，但是沒(méi)有讓我們特別開(kāi)心、驚喜非常自信地的結(jié)果。這個(gè)小分子有機(jī)物是對(duì)于膝關(guān)節(jié)里面滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞有軟骨方向的分化。
    到這一步以后，我們就想既然它有這樣的作用，那就往關(guān)節(jié)內(nèi)打打。于是我們就設(shè)計(jì)了第二部分，就是把這個(gè)小分子有機(jī)物往關(guān)節(jié)內(nèi)打打，因此我們把在膝關(guān)節(jié)挖了一個(gè)洞，每個(gè)禮拜打一次，連續(xù)打三個(gè)月。到4個(gè)禮拜和12個(gè)禮拜的時(shí)候，我們?nèi)タ催@個(gè)兔子的組織。我們發(fā)現(xiàn)到4個(gè)禮拜的時(shí)候，雖然說(shuō)跟對(duì)照?qǐng)D比有明顯的縮小，但是沒(méi)有看到讓我們特別開(kāi)心、驚喜的結(jié)果。但是到12個(gè)禮拜的時(shí)候，我們發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)內(nèi)打小分子有機(jī)物的注射組，明顯跟對(duì)照組比，有很好的治療作用，填充非常完整，邊緣相連。我們知道其實(shí)作為軟骨修復(fù)來(lái)講，它不止是軟骨和軟骨下骨的一個(gè)緊密連接，包括軟骨和周圍軟骨的緊密連接，是一個(gè)三維一體化的過(guò)程。所以緊接著我們用了甲苯胺藍(lán)色，我們發(fā)現(xiàn)4個(gè)禮拜的時(shí)候，跟對(duì)照比好像小了一點(diǎn)點(diǎn)，但是到12周的時(shí)候，發(fā)現(xiàn)我們?cè)陉P(guān)節(jié)內(nèi)打的這樣一個(gè)控制它軟骨修復(fù)最糟糕的一組，都比我們對(duì)照組要好很多。我們用番紅O染色去驗(yàn)證我們這樣的結(jié)果，同樣地發(fā)現(xiàn)，我們治療組的最差的都比對(duì)照組最好的都要好很多。于是，我們又去做了II型膠原免疫組化，我們發(fā)現(xiàn)這樣的一個(gè)組織跟對(duì)照組比，顯然是有更多的II型膠原的表達(dá)。同時(shí)我們也檢測(cè)了I型膠原，發(fā)現(xiàn)修復(fù)組織I型膠原的表達(dá)是很弱的。所以從這一步來(lái)講，就是可以得出這樣的結(jié)論，就是關(guān)節(jié)腔里打這樣的小分子有機(jī)物，是可以治療軟骨缺損，我們也發(fā)表在arthritis research  therapy這樣的的雜志上。
    其實(shí)這個(gè)過(guò)程還有很多的問(wèn)題，想要去做臨床轉(zhuǎn)化的，因?yàn)槲覀兌贾�道反�?fù)地這樣的注射，對(duì)我們外科大夫來(lái)講是非常擔(dān)心的，因?yàn)椴煌５刈⑸淙齻�(gè)月的話，非常容易感染。而且我們關(guān)節(jié)內(nèi)，到底到我真正缺損的地方有多少有效的治療濃度？這也是有困惑的。同時(shí)，如果對(duì)南京的病人來(lái)講，他一個(gè)禮拜來(lái)打一次，打三個(gè)月，可能他還可以接受。如果是哈爾濱或者是北京的話，讓他每周來(lái)打一次，顯然在臨床上是不可能推開(kāi)的。
    于是我當(dāng)時(shí)考慮想在缺損的地方，表面能夠有一個(gè)噴霧的東西，噴到關(guān)節(jié)的表面，就變成一層固定的膜。但是我當(dāng)時(shí)沒(méi)有參加過(guò)這樣的會(huì)，如果有這么多老師知道我就好了。我跑到南大的高分子系，跑到很多搞高分子的地方。如果有一個(gè)東西，像噴霧噴到缺損的地方，變成堅(jiān)硬的膜，來(lái)兜住我自己的藥物的話，這是非常困難的。因?yàn)橹挥羞@樣的一個(gè)操作過(guò)程，才能可能在臨床上操作，我可以噴點(diǎn)霧噴到缺損的地方，然后形成固體，或者在體溫作用下變成固體，能夠兜住局部的藥物，這才是可能轉(zhuǎn)化的。
    經(jīng)過(guò)一年多的尋找，我才尋找到這樣的材料。我跟我高中同學(xué)聊天，聊聊我在做什么、我在做什么，把我的困惑告訴他。非常幸運(yùn)的是他正好做高分子，然后他說(shuō)我?guī)湍闳ハ胂脒@個(gè)東西能不能去解決，但是不一定是這種膜。于是他就回去，我們也不停地在溝通交流。于是回去以后他做了一個(gè)月告訴我，他說(shuō)我想了，可不可以用在臨床上？他說(shuō)我把你這個(gè)藥物包裹在液體里面，然后打到你缺損的地方，我給你固化，這樣局部的液體就不會(huì)跑，而且能給你有效釋放，到底釋放能多少？可能還需要我們一起討論。于是他進(jìn)行了另一個(gè)實(shí)驗(yàn)，他發(fā)現(xiàn)HA照射了以后又變成了固體。
    同時(shí)，我就四處找可以發(fā)紫外光的機(jī)器。后來(lái)好不容易在蘇州發(fā)現(xiàn)有這樣的發(fā)光器，因?yàn)橹挥羞@樣的發(fā)光器，才有可能在臨床上，我在膝關(guān)節(jié)打一個(gè)洞，高溫消毒以后，可以在關(guān)節(jié)內(nèi)使用。
    現(xiàn)在匯報(bào)的時(shí)候，可以把幾秒鐘的東西過(guò)一下，其實(shí)我們光這個(gè)紫外光發(fā)光的條件就用了三個(gè)月，就是到底在缺損的地方距離多遠(yuǎn)、發(fā)光的強(qiáng)度多少、時(shí)間有多長(zhǎng)，其實(shí)這是反復(fù)過(guò)程當(dāng)中。一開(kāi)始做的時(shí)候，一發(fā)光就把軟骨燒紅了。所以在不斷摸索的過(guò)程中，才找到了相對(duì)比較可靠的照射過(guò)程。
    同時(shí)，他又幫我把它這個(gè)小分子有機(jī)物用納米包裹，他發(fā)現(xiàn)在體外顯示方兩個(gè)月，基本上在這樣的包裹下問(wèn)題不大。如果前面兩部分的實(shí)驗(yàn)是非常可靠的話，其實(shí)到了第三部分，這樣的試驗(yàn)結(jié)果是我們很有信心，一定會(huì)比前面兩次更好。所以我們到12周三個(gè)月的時(shí)候，發(fā)現(xiàn)這樣的軟骨和天然軟骨幾乎沒(méi)有任何的差別。
    同時(shí)，我們做了各種染色，包括甲苯胺，包括番紅染色的評(píng)分，都跟天然的沒(méi)有太大的區(qū)別。到了4個(gè)禮拜的時(shí)候，我們從番紅染色看，還有幾個(gè)支架還在，還沒(méi)有完全吸收。但是跟4個(gè)禮拜的對(duì)照?qǐng)D比，有明顯的很好的修復(fù)作用。到12周的時(shí)候，我們特別開(kāi)心，因?yàn)槲覀儼l(fā)現(xiàn)這樣的修復(fù)組織周圍的液體基本上沒(méi)有了，這樣的修復(fù)過(guò)程發(fā)現(xiàn)，跟周圍正常軟骨比，發(fā)現(xiàn)跟它之間沒(méi)有任何的變化。
    我們用番紅進(jìn)行染色，更讓我們興奮的是我們發(fā)現(xiàn)這樣的軟骨跟這樣的軟骨下骨的完全已經(jīng)緊密結(jié)合在一起，沒(méi)有用分體的支架粘在一起，完全是靠同一個(gè)支架在不同環(huán)境作用下進(jìn)行自己的軟骨生長(zhǎng)。我們現(xiàn)在也投入很大的課題組，專門想看為什么這樣一個(gè)交界的地方，在周圍骨環(huán)境的情況下，跟周圍關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨不同微環(huán)境下，為什么骨、軟骨能夠一體化長(zhǎng)得這么好。
    我們進(jìn)行了II型膠原修復(fù)表達(dá)，我們發(fā)現(xiàn)這樣的修復(fù)組織的II型膠原表達(dá)甚至比周圍軟骨的II型膠原軟骨的表達(dá)更要好，說(shuō)明我們這樣一個(gè)修復(fù)組織是非常接近于類天然軟骨。我們又去做I型膠原，就是說(shuō)我們這樣的修復(fù)組織，基本上不會(huì)是這樣的纖維軟骨的成分。
    我們隨機(jī)取了一些修復(fù)的軟骨條和正常的軟骨條，我們送到北醫(yī)三院敖英芳進(jìn)行檢測(cè)生物醫(yī)學(xué)，無(wú)論是硬度方面，跟正常軟骨相比都沒(méi)有太大的區(qū)別，說(shuō)明我們這樣的修復(fù)軟骨是非常接近天然透明軟骨。
    其實(shí)對(duì)于我們臨床大夫來(lái)講，想要在臨床上能夠推廣或者非常好地利用，現(xiàn)在也是大家關(guān)心的。因?yàn)槲覀冞@樣的技術(shù)，跟原來(lái)的軟骨細(xì)胞技術(shù)相比，大家都知道原來(lái)的軟骨細(xì)胞要取正常的非修復(fù)性的軟骨進(jìn)行體外培養(yǎng)再植入體內(nèi)。這樣的兩步法，造成了這樣的軟骨細(xì)胞移植手術(shù)并不得到臨床大夫的非常認(rèn)可，第一當(dāng)然是因?yàn)樗�的費(fèi)用非常貴，就算它搞活動(dòng)，打折下來(lái)也要5萬(wàn)塊錢。我們這樣成本，只要2萬(wàn)多塊錢能解決，從成本上得到很好的降低。同時(shí)，我們不需要開(kāi)放手術(shù)，只需要在關(guān)節(jié)下操作，我們?cè)诖蛑Ъ艿臅r(shí)候，可以把關(guān)節(jié)內(nèi)液體全部吸掉，暴露缺損的地方，我們可以把這樣的支架注入到這樣的地方。更重要的是，其實(shí)軟骨并不是大家想象中的規(guī)則的圓柱形、立方體的，所有的骨軟骨移植手術(shù)都需要破壞正常的軟骨。而我們這樣的情況下，無(wú)論你損傷的軟骨是什么樣的形狀，我們不關(guān)心，我們用這樣的液體支架植入你原來(lái)?yè)p傷的組織，而且我們根本不需要取任何軟骨細(xì)胞，也不需要體外的干細(xì)胞，完全利用體內(nèi)的滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞，還有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行這樣的工作。
    這樣的國(guó)家發(fā)明專利，我們現(xiàn)在在談怎么樣在林場(chǎng)上進(jìn)一步推廣。我想用一個(gè)簡(jiǎn)單的動(dòng)畫給大家介紹一下我們這樣的技術(shù)，其實(shí)這樣的缺損是不規(guī)則的，我們把它打進(jìn)去以后變成固體的支架，同時(shí)在局部釋放我們的藥物，周圍各種種子細(xì)胞的歸巢，最后修復(fù)。謝謝！