3D 打印硅酸鍶誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞預(yù)神經(jīng)化支架修復(fù)梗死心肌

來源：EFL生物3D打印與生物制造

心肌梗死（MI）修復(fù)面臨的關(guān)鍵挑戰(zhàn)在于成年心肌細(xì)胞再生能力有限，且傳統(tǒng)治療（如血管成形術(shù)）僅聚焦局部血運(yùn)重建，忽視神經(jīng)調(diào)控對(duì)心臟生理活動(dòng)的系統(tǒng)性作用�，F(xiàn)有神經(jīng)調(diào)節(jié)策略（如迷走神經(jīng)刺激、藥物激活）因信號(hào)控制復(fù)雜和潛在副作用，臨床應(yīng)用受限。此外，神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）雖具分化為神經(jīng)元的潛力，但其分化方向難控，依賴生長(zhǎng)因子的傳統(tǒng)誘導(dǎo)方法存在穩(wěn)定性和生物安全性問題。   

針對(duì)上述痛點(diǎn)，中國(guó)科學(xué)院上海硅酸鹽研究所吳成鐵研究員團(tuán)隊(duì)開發(fā)了基于3D生物打印技術(shù)的“預(yù)神經(jīng)化”支架。該團(tuán)隊(duì)將硅酸鍶（SrSiO₃）微粒子與NSCs結(jié)合，利用3D打印構(gòu)建多孔支架，通過Sr²⁺和Si²⁻離子釋放誘導(dǎo)NSCs定向分化為成熟神經(jīng)元，形成具有神經(jīng)調(diào)節(jié)功能的活性支架。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明，該支架可增強(qiáng)心肌細(xì)胞成熟和同步收縮，激活晝夜節(jié)律相關(guān)基因（如Per2、Usp24）促進(jìn)心肌修復(fù)，改善心梗大鼠心臟功能。相關(guān)工作以“Inorganic Biomaterials Inducing Scaffolds Pre㎞euralization for Infarcted Myocardium”為題發(fā)表在《Advanced Materials》上。論文第一作者為上海硅酸鹽所博士研究生王之栩，通訊作者為吳成鐵研究員。

預(yù)神經(jīng)化支架的設(shè)計(jì)制備及其用于梗死心肌修復(fù)的示意圖。由于硅酸鍶的作用，3D 生物打印支架中的神經(jīng)干細(xì)胞被誘導(dǎo)分化為成熟神經(jīng)元。將預(yù)神經(jīng)化支架植入心肌梗死大鼠體內(nèi)后，其通過調(diào)控晝夜節(jié)律相關(guān)基因，加速了梗死心肌的修復(fù)。

1. 硅酸鍶微粒子及3D打印支架的表征，通過掃描電子顯微鏡（SEM）、X射線衍射（XRD）、流變學(xué)分析和離子釋放實(shí)驗(yàn)等方法，研究了不同濃度硅酸鍶（SS）微粒子（0%、2%、5%、10%）的形貌、物相、生物墨水打印性能及Sr/Si離子釋放規(guī)律。結(jié)果表明，SS微粒子呈六方棱柱形，5SS-GelMA支架兼具良好打印性和離子釋放穩(wěn)定性，Sr/Si離子在7天內(nèi)基本完全釋放，與神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）分化時(shí)間窗匹配。      

圖1. 硅酸鍶微粒子及3D打印支架的表征。   

2. 預(yù)神經(jīng)化支架的體外神經(jīng)分化行為，利用實(shí)時(shí)定量PCR（RT-qPCR）、免疫熒光染色和EdU增殖實(shí)驗(yàn)，研究了NSCs在不同SS濃度支架中的分化、增殖及毒性反應(yīng)。結(jié)果顯示，5% SS濃度（5SS-GelMA-NSC）顯著促進(jìn)NSCs向神經(jīng)元分化（Tuj1+和MAP2+細(xì)胞比例升高），抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物GFAP表達(dá)，且7天為最佳預(yù)神經(jīng)化時(shí)間，此時(shí)離子釋放與分化效果同步。      

圖2. 硅酸鍶微粒子誘導(dǎo)3D打印神經(jīng)干細(xì)胞負(fù)載支架的神經(jīng)元分化行為。   

3. 硅酸鍶促進(jìn)NSCs分化的機(jī)制，通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、離子濃度梯度實(shí)驗(yàn)和免疫熒光染色，分析了SS調(diào)控NSCs分化的分子通路及離子作用機(jī)制。結(jié)果表明，SS通過激活軸突導(dǎo)向和鞘脂代謝相關(guān)基因（如MAP2），且Sr/Si離子濃度為125 μg/mL時(shí)可有效誘導(dǎo)神經(jīng)元成熟，過高濃度（500 μg/mL）則具細(xì)胞毒性。      

圖3. 硅酸鍶促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化的機(jī)制及不同濃度提取液中NSCs的分化行為表征。   

4. 預(yù)神經(jīng)化支架對(duì)心肌構(gòu)建體的體外作用，通過鈣瞬變實(shí)驗(yàn)、免疫熒光染色和基因表達(dá)分析，研究了預(yù)神經(jīng)化支架與心肌細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)的功能調(diào)控。結(jié)果顯示，5SS-GelMA-NSC支架顯著增強(qiáng)心肌細(xì)胞搏動(dòng)同步性（鈣信號(hào)同步化）、連接蛋白Cx43表達(dá)及收縮相關(guān)基因（Myh6/Myh7）活性，促進(jìn)心肌結(jié)構(gòu)成熟。      

圖4. 3D打印心肌細(xì)胞負(fù)載支架與神經(jīng)干細(xì)胞負(fù)載支架共培養(yǎng)的心肌細(xì)胞活性表征。   

5. 預(yù)神經(jīng)化支架的體內(nèi)心肌修復(fù)效果，利用大鼠心肌梗死模型、超聲心動(dòng)圖和組織染色（Masson’s Trichrome、WGA等），評(píng)估了支架植入后的心臟功能及組織修復(fù)。結(jié)果表明，5SS-GelMA-NSC組大鼠左心室射血分?jǐn)?shù)（EF）和縮短分?jǐn)?shù)（FS）顯著提升，梗死面積減少，心肌細(xì)胞肥大減輕，且促進(jìn)血管新生（vWF+和α-SMA+血管密度增加）。      

圖5. 支架移植后大鼠心臟功能評(píng)估。   

6. 心肌損傷修復(fù)的組織學(xué)觀察，通過Masson’s Trichrome染色、小麥胚芽凝集素（WGA）染色和免疫熒光染色，研究了支架植入4周后大鼠心肌梗死區(qū)域的組織結(jié)構(gòu)修復(fù)。結(jié)果顯示，5SS-GelMA-NSC組梗死區(qū)域纖維組織比例最低，左心室壁厚度最大，心肌細(xì)胞代償性肥大顯著緩解，且Cx43、α-actinin等心肌功能相關(guān)蛋白表達(dá)升高，血管密度增加。      

圖6. 支架移植4周后大鼠心臟梗死區(qū)域的組織學(xué)表征。   

7. 預(yù)神經(jīng)化支架的修復(fù)機(jī)制，通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和基因表達(dá)驗(yàn)證，分析了支架誘導(dǎo)心肌修復(fù)的分子通路。結(jié)果顯示，5SS-GelMA-NSC激活晝夜節(jié)律相關(guān)基因（Per2、Per1、Usp2、Ciart），其中Per2蛋白表達(dá)顯著升高，可能通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和血管生成促進(jìn)心肌修復(fù)。      

圖7. 預(yù)神經(jīng)化支架促進(jìn)心肌修復(fù)的機(jī)制及晝夜節(jié)律相關(guān)基因和蛋白表達(dá)表征。

研究結(jié)論
本研究制備了由無機(jī)材料硅酸鍶微粒子誘導(dǎo)的負(fù)載神經(jīng)細(xì)胞的支架用于心肌梗死修復(fù)。硅酸鍶微粒子通過釋放適當(dāng)濃度的鍶和硅離子，調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞的分化并促進(jìn)神經(jīng)元成熟，實(shí)現(xiàn)了負(fù)載神經(jīng)干細(xì)胞支架的預(yù)神經(jīng)化改造。在預(yù)神經(jīng)化支架中，神經(jīng)元無需人工信號(hào)引導(dǎo)即可促進(jìn)心肌細(xì)胞功能修復(fù)梗死心肌，對(duì)受損心肌的結(jié)構(gòu)恢復(fù)和功能重建效果顯著。研究發(fā)現(xiàn)，預(yù)神經(jīng)化支架似乎激活了四種與心臟保護(hù)相關(guān)的典型晝夜節(jié)律基因�；�于神經(jīng)調(diào)節(jié)器官晝夜節(jié)律的能力，推測(cè)含有神經(jīng)元的預(yù)神經(jīng)化支架可能通過影響晝夜節(jié)律相關(guān)基因的表達(dá)促進(jìn)心肌梗死修復(fù)。因此，硅酸鍶微粒子預(yù)神經(jīng)化支架從晝夜生物過程角度激活了受損心肌的結(jié)構(gòu)恢復(fù)和功能重建，為心肌梗死修復(fù)提供了一種有前景的策略。

文章來源：https://doi.org/10.1002/adma.202419765