3D 打印磷酸鈣陶瓷孔隙架構(gòu)與骨誘導(dǎo)性的關(guān)聯(lián)及優(yōu)化策略

來源：EFL生物3D打印與生物制造

在骨修復(fù)領(lǐng)域，理想的骨替代物應(yīng)具備個性化外形與可調(diào)節(jié)內(nèi)部多孔結(jié)構(gòu)，以滿足精準(zhǔn)醫(yī)療需求。3D打印技術(shù)的發(fā)展為制備復(fù)雜結(jié)構(gòu)的骨替代物帶來可能，其中數(shù)字光處理（DLP）打印技術(shù)具有成型效率高、精度高和表面質(zhì)量好等優(yōu)勢，適用于制備多孔磷酸鈣（CaP）陶瓷。CaP生物陶瓷因良好的生物相容性和生物活性，在骨科領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。然而，目前3D打印CaP陶瓷的骨誘導(dǎo)性與傳統(tǒng)發(fā)泡法制備的陶瓷相比存在較大差距，這限制了其在骨再生中的應(yīng)用。盡管已有多種增強(qiáng)3D打印CaP生物陶瓷成骨能力的嘗試，如摻雜、加載藥物和添加生長因子等，但這些方法存在改變底物成分、潛在危害健康和成本高昂等問題。  

四川大學(xué)國家生物醫(yī)學(xué)材料工程技術(shù)研究中心張興棟院士、朱向東研究員、李向鋒副研究員團(tuán)隊(duì)，通過優(yōu)化孔隙架構(gòu)來提升3D打印CaP陶瓷的骨誘導(dǎo)性。團(tuán)隊(duì)制備了具有六方密堆積（HCP）球形孔結(jié)構(gòu)的CaP陶瓷，并構(gòu)建了八面體、菱形和螺旋形結(jié)構(gòu)作為對照。研究系統(tǒng)地探究了不同孔隙架構(gòu)對陶瓷的結(jié)構(gòu)、力學(xué)性能、滲透性以及細(xì)胞行為和體內(nèi)骨誘導(dǎo)性的影響。相關(guān)工作以“3D printing calcium phosphate ceramics with high osteoinductivity through pore architecture optimization”為題發(fā)表在《Acta Biomaterialia》上。

不同孔隙結(jié)構(gòu)的雙相磷酸鈣（BCP）陶瓷成骨活性示意圖。

研究內(nèi)容
1. 通過設(shè)計八面體、菱形、螺旋形和六方密堆積（HCP）四種孔隙結(jié)構(gòu)的模型，使用DLP打印技術(shù)制備磷酸鈣（CaP）陶瓷，利用立體顯微鏡、掃描電鏡、X射線衍射儀和壓汞儀等進(jìn)行表征分析，研究了不同孔隙結(jié)構(gòu)CaP陶瓷的微觀和宏觀結(jié)構(gòu)、相組成、孔隙特征。結(jié)果表明，成功制備出具有特定孔隙結(jié)構(gòu)的CaP陶瓷，其相組成包含HA和β -TCP ，不同結(jié)構(gòu)的陶瓷在孔隙率、孔徑等方面存在差異，且均有豐富微孔，晶粒尺寸相似。

圖1. 具有八面體、菱形、螺旋形和六方密堆積結(jié)構(gòu)的BCP生物陶瓷的頂部和側(cè)面3D視圖、光學(xué)照片、SEM圖像、XRD圖譜、孔徑分布和孔數(shù)量分布。  

2. 運(yùn)用有限元分析和數(shù)值流體流動分析方法，結(jié)合萬能材料試驗(yàn)機(jī)測試，研究不同孔隙結(jié)構(gòu)CaP陶瓷的力學(xué)性能和滲透率。結(jié)果顯示，HCP結(jié)構(gòu)的CaP陶瓷壓縮強(qiáng)度和彈性模量最高，應(yīng)力分布更均勻；其流體流速和滲透率在四種結(jié)構(gòu)中最低，螺旋形結(jié)構(gòu)的滲透率最高。同時，孔隙幾何結(jié)構(gòu)對陶瓷燒結(jié)收縮率影響較小，八面體、螺旋形和HCP結(jié)構(gòu)的比表面積無顯著差異，菱形結(jié)構(gòu)比表面積較低。

圖2. BCP生物陶瓷的壓縮強(qiáng)度測試觀察、壓縮載荷下孔隙單元的應(yīng)力分布、模型內(nèi)模擬流線、模型橫截面的速度分布、壓縮強(qiáng)度、彈性模量和實(shí)際滲透率分析。  

3. 采用體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，借助共聚焦激光掃描顯微鏡觀察細(xì)胞生長和增殖，進(jìn)行CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖，計算細(xì)胞層平均厚度，研究不同孔隙結(jié)構(gòu)對MC3T3-E1細(xì)胞行為的影響。結(jié)果表明，細(xì)胞在各樣本孔壁均能黏附和鋪展，HCP結(jié)構(gòu)組細(xì)胞生長均勻并形成圓環(huán)，雖然四組細(xì)胞增殖無顯著差異，但HCP組細(xì)胞層平均厚度最大。

圖3. MC3T3-E1細(xì)胞的死活染色和F-肌動蛋白的CLSM觀察、高斯曲率、細(xì)胞生長輪廓、CCK-8結(jié)果以及細(xì)胞層平均厚度。  

4. 對在不同孔隙結(jié)構(gòu)CaP陶瓷上培養(yǎng)7天的MC3T3-E1細(xì)胞進(jìn)行ALP染色，對培養(yǎng)14天的細(xì)胞進(jìn)行OCN和BMP-2免疫熒光染色，采用實(shí)時定量逆轉(zhuǎn)錄PCR分析細(xì)胞培養(yǎng)7天和14天時相關(guān)成骨基因的表達(dá)，研究不同孔隙結(jié)構(gòu)CaP陶瓷對細(xì)胞骨向分化的影響。結(jié)果顯示，HCP組的ALP活性相對較高，能顯著促進(jìn)BMP-2和OCN的高水平表達(dá)，且在成骨基因（Col-I、Runx-2、Osx、Ocn和Alp）表達(dá)上表現(xiàn)更優(yōu)。

圖4. MC3T3-E1細(xì)胞在不同孔隙結(jié)構(gòu)CaP陶瓷上培養(yǎng)的ALP染色、OCN和BMP-2免疫熒光染色、成骨基因表達(dá)以及OCN和BMP-2的平均光密度（MOD）值。  

5. 將不同孔隙結(jié)構(gòu)的CaP陶瓷植入犬肌肉內(nèi)，在6周和10周后取材進(jìn)行H&E染色、μ -CT掃描重建，研究不同孔隙結(jié)構(gòu)CaP陶瓷的體內(nèi)骨誘導(dǎo)性。結(jié)果表明，HCP結(jié)構(gòu)組新骨形成最多，植入10周后新骨面積占比最高，骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）變化百分比最大，其骨誘導(dǎo)性在四組中最強(qiáng)。

圖5. 犬肌肉內(nèi)植入6周和10周后多孔BCP陶瓷的H&E染色、μ -CT重建3D可視化、骨發(fā)生率、新骨面積和BV/TV百分比變化。  

6. 在犬肌肉內(nèi)植入實(shí)驗(yàn)中，對植入6周和10周后的不同孔隙結(jié)構(gòu)CaP陶瓷進(jìn)行免疫熒光染色（CD31、α -SMA）和免疫組化染色（OCN），并分析相關(guān)蛋白表達(dá)的平均光密度（MOD）值，研究其體內(nèi)血管生成和骨誘導(dǎo)相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果表明，所有組的CaP陶瓷都能促進(jìn)CD31和α -SMA的表達(dá)，HCP組在術(shù)后6周時CD31表達(dá)最高，10周時α -SMA表達(dá)顯著高于部分組；同時，HCP組的OCN陽性表達(dá)明顯更高。

圖6. 犬肌肉內(nèi)植入6周和10周后，八面體、菱形、螺旋形和HCP結(jié)構(gòu)的CD31和α -SMA免疫熒光染色、OCN免疫組化染色以及CD31、α -SMA和OCN的MOD值。  

7. 建立兔股骨髁臨界尺寸缺損模型，植入不同孔隙結(jié)構(gòu)的CaP陶瓷，8周后利用μ -CT重建和組織學(xué)染色，研究不同孔隙結(jié)構(gòu)CaP陶瓷的體內(nèi)骨再生能力。結(jié)果表明，HCP結(jié)構(gòu)組與宿主骨整合良好，新骨形成量顯著高于其他組，骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）、小梁數(shù)量（Tb.N）和小梁厚度（Tb.Th）等指標(biāo)表現(xiàn)更優(yōu)。

圖7. 植入兔股骨缺損8周后，八面體、菱形、螺旋形和HCP結(jié)構(gòu)的材料與新骨整合的3D重建μ -CT圖像、亞甲基藍(lán)和堿性品紅染色、新骨體積與總?cè)睋p體積的定量分析、新骨面積、殘余體積與總?cè)睋p體積、小梁數(shù)量和小梁厚度。

研究結(jié)論
本研究系統(tǒng)評估了不同孔隙結(jié)構(gòu)對雙相磷酸鈣（BCP）陶瓷理化和生物學(xué)性能的影響。結(jié)果顯示，在四種研究結(jié)構(gòu)中，HCP組的抗壓強(qiáng)度最高，滲透率最低。具有球形凹孔結(jié)構(gòu)的HCP組，能夠促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞的黏附、增殖和骨向分化。與八面體、菱形和螺旋形結(jié)構(gòu)組相比，HCP組在體內(nèi)表現(xiàn)出更優(yōu)異的血管生成能力和骨誘導(dǎo)性。通過兔股骨髁缺損修復(fù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，HCP組具有令人滿意的骨修復(fù)能力。這些結(jié)果表明，構(gòu)建具有六方密堆積結(jié)構(gòu)、球形凹面的孔隙結(jié)構(gòu)，是增強(qiáng)3D打印BCP陶瓷力學(xué)性能、骨誘導(dǎo)性和骨再生能力的有效途徑。

文章來源：
https://doi.org/10.1016/j.actbio.2024.07.008