《AFM》：3D打印多尺度仿生支架用于肌腱再生

【研究背景】

人體組織由細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）構(gòu)成，考慮到ECM是一個(gè)典型的由生物材料構(gòu)成的多尺度三維微納結(jié)構(gòu)。如能體外仿生構(gòu)建出類似的生物支架，無(wú)疑能大幅提升其在體內(nèi)的再生性能。

EFL團(tuán)隊(duì)報(bào)道了一種3D打印的仿生多尺度支架，這種多尺度仿生肌腱（MBT）支架在宏觀、微觀和納米尺度上模擬了肌腱的特征。通過(guò)熔融擠出3D打印構(gòu)建多孔外殼，仿生肌腱腱鞘結(jié)構(gòu)；通過(guò)近場(chǎng)直寫3D打印和雜化串晶技術(shù)分別構(gòu)建波紋纖維和Shish-Kebab結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)對(duì)仿生肌腱波紋狀的微米級(jí)膠原纖維結(jié)構(gòu)和納米級(jí)的膠原原纖維結(jié)構(gòu)（圖1）的仿生。

MBT支架的抗拉強(qiáng)度高達(dá)6.94 MPa，通過(guò)纖維上的Shish-Kebab結(jié)構(gòu)和甲基丙烯�；髂z（GelMA）增強(qiáng)了肌腱干/祖細(xì)胞（TSPCs）的粘附和增殖。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，MBT支架可手術(shù)縫合于肌腱缺損區(qū)，實(shí)現(xiàn)促進(jìn)肌腱組織的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)，加速肌腱組織的再生。

相關(guān)研究以“3D Printing of Multiscale Biomimetic Scaffold for Tendon Regeneration”為題發(fā)表在《Advanced Functional Materials》。浙江大學(xué)的賀永教授、湖州師范學(xué)院的馬志勇副教授和貴州大學(xué)的陳躍威副教授為論文共同通訊作者，共同第一作者為姚克博士、呂尚博士和張新杰博士。

圖1 多尺度仿生肌腱支架的多級(jí)結(jié)構(gòu)

研究者首先采用MEW技術(shù)分別打印收集纖維和卷曲纖維層（圖2（a）（b））。收集纖維直徑為40-60um，作為收集第二層卷曲纖維的基礎(chǔ)。收集纖維被設(shè)計(jì)成復(fù)制肌腱膠原纖維的螺旋結(jié)構(gòu)，提供結(jié)構(gòu)支撐并吸收徑向張力下的變形。卷曲纖維的直徑為5-10um，用于模擬膠原纖維的波浪結(jié)構(gòu)。然后，將支架浸入過(guò)飽和PCL/乙酸（HOAc）溶液中，誘導(dǎo)纖維表面形成類似于膠原原纖維螺旋結(jié)構(gòu)的納米雜交Shish-Kebab結(jié)構(gòu)（圖2（c））。隨后研究者通過(guò)旋轉(zhuǎn)打印制備了多孔外殼，然后，將收集和卷曲的纖維卷成管狀，并加入GelMA水凝膠。最終，通過(guò)組裝正式支架和外殼結(jié)構(gòu)創(chuàng)建MBT支架，如圖2(e)所示。

圖2 多尺度仿生肌腱支架制造工藝

進(jìn)一步，研究者研究了MBT支架的力學(xué)性能。在外殼支架部分，綜合考慮力學(xué)性能及支架的可降解性，旋轉(zhuǎn)45度作為外殼支架的打印參數(shù)。在核心支架部分，驗(yàn)證了MBT支架具有的波紋結(jié)構(gòu)，能夠仿生肌腱組織的J型應(yīng)力-應(yīng)變曲線特性（圖3（g）），這種卷曲的形態(tài)允許纖維吸收更大的張力，有效地幫助管理相關(guān)肌肉或骨骼所施加的機(jī)械負(fù)荷。

圖3 多尺度仿生肌腱支架的力學(xué)性能

研究者發(fā)現(xiàn)，MBT支架所具有的波紋結(jié)構(gòu)，能夠誘導(dǎo)肌腱干細(xì)胞延卷曲結(jié)構(gòu)生長(zhǎng)，這表明波紋結(jié)構(gòu)微細(xì)胞提高拓?fù)湟龑?dǎo)，誘導(dǎo)細(xì)胞在體外構(gòu)建類似體內(nèi)的卷曲結(jié)構(gòu)。同時(shí)通過(guò)CCK8實(shí)驗(yàn)，研究者也驗(yàn)證了納米Shish-Kebab結(jié)構(gòu)和GelMA水凝膠可以顯著促進(jìn)細(xì)胞粘附和增殖，從而進(jìn)一步改善TSPCs功能和組織重塑（圖4）。

圖4 多尺度仿生肌腱支架誘導(dǎo)TSPCs定向生長(zhǎng)

不僅如此，研究者證實(shí)了MBT支架能夠顯著促進(jìn)TSPCs在體外的一型膠原蛋白、BGN和DCN的功能性表達(dá)，這證明了多尺度仿生支架在體外構(gòu)建肌腱ECM中的有效性，對(duì)進(jìn)一步作為組織替代品的應(yīng)用具有重要意義（圖5）。

圖5 多尺度仿生肌腱支架有效支持TSPCs的功能性表達(dá)

最后，研究者構(gòu)建了兔全層肌腱損傷模型，將MBT支架縫合至肌腱缺損處，進(jìn)一步評(píng)估MBT支架促進(jìn)肌腱再生的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MBT支架在早期愈合過(guò)程中可以促進(jìn)肌腱再生；相較于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組有更致密的膠原沉積，并呈現(xiàn)與實(shí)際組織相似的波紋結(jié)構(gòu)；并且在12周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組具有較少的CD31+區(qū)域，表明炎癥細(xì)胞和血管減少，具有更好的修復(fù)效果。這些結(jié)果表面，與對(duì)照組相比，MBT支架在促進(jìn)肌腱缺損快速再生方面具有更好的效果。