圖案化納米纖維膜+水凝膠制備生物3D打印人造皮膚替代品

來源： EFL生物3D打印與生物制造

生物3D打印在構(gòu)建人造皮膚組織、復(fù)制天然皮膚的結(jié)構(gòu)和功能方面具有優(yōu)勢。盡管許多研究表明打印皮膚替代品在傷口愈合中的效果有所改善，但使用水凝膠墨水制造具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)、模仿機(jī)械性能和適當(dāng)細(xì)胞環(huán)境的生物3D打印結(jié)構(gòu)仍然具有挑戰(zhàn)性。

受膠原納米纖維承受壓力和調(diào)節(jié)細(xì)胞行為的啟發(fā)，中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院趙曉麗團(tuán)隊(duì)將圖案化的納米纖維膜引入印刷水凝膠支架中，以制造復(fù)合人造皮膚替代品（CASS）。模仿膠原蛋白的納米纖維膜有效提高了CASS的拉伸強(qiáng)度和抗斷裂性，使其可縫合以牢固地植入皮膚缺損處。同時(shí)，圖案化的納米纖維膜還提供了引導(dǎo)細(xì)胞行為的生物線索。因此，CASS通過促進(jìn)上皮再形成和膠原沉積，有效加速小鼠和豬模型中大面積皮膚缺損的再生（方案1）。

相關(guān)研究成果以“3D Bioprinting of Artificial Skin Substitute with Improved Mechanical Property and Regulated Cell Behavior through Integrating Patterned Nanofibrous Films”為題于2024年6月28日在線發(fā)表在《ACS Nano》上。

方案1  生物3D打印CASS及其在傷口愈合中的應(yīng)用示意圖

1. 混合水凝膠油墨的制備與表征

復(fù)合人造皮膚替代品（CASS）是通過在印刷水凝膠支架中引入圖案化納米纖維（PN）薄膜來使用仿生策略制備的。作者選擇由明膠（Gel-MA）和透明質(zhì)酸（HA-MA）組成的混合水凝膠作為印刷油墨，以模擬天然皮膚組織的化學(xué)成分。因此，首先研究了這種油墨的可印刷性和物理化學(xué)性質(zhì)。通過流變測試、實(shí)際打印效果評估、降解速率評估、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動態(tài)流變分析篩選出具有良好生物相容性和較高機(jī)械性能的G10H2凝膠（即Gel-MA濃度為10，HA-MA濃度為2）作為水凝膠油墨（圖1）。

圖1 雜化水凝膠油墨的表征

2. PN薄膜的制備和表征

PN薄膜旨在集成到CASS中，以改善其機(jī)械性能并提供膠原蛋白模擬生物線索。由于具有緊密堆積的納米纖維結(jié)構(gòu)的一般靜電紡絲薄膜可能會阻礙細(xì)胞通過薄膜的遷移，因此構(gòu)建了具有貫穿孔的圖案化靜電紡絲納米纖維薄膜，這些薄膜通過靜電紡絲收集在具有直徑 2.0  mm貫穿孔的圖案不銹鋼板上（圖 2A）。SEM、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)說明P15G1.5-5薄膜（即聚乳酸-乙醇酸(PLGA)含量為15% w/v，Gel-MA含量為1.5% w/v，紡絲時(shí)間為5 min）允許人真皮成纖維細(xì)胞 （HDF）穿透孔隙到達(dá)培養(yǎng)皿，因此選擇該薄膜進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，并將其命名為PN薄膜。

圖2 PN膜的表征

3. PN薄膜增強(qiáng)復(fù)合人造真皮（CAD）的機(jī)械性能

通過打印具有梯度孔隙的水凝膠支架并將PN薄膜插入其中來構(gòu)建CAD，以便從外到內(nèi)模擬分層的天然皮膚組織，包括基底層、真皮和網(wǎng)狀真皮。本文按照水凝膠-膜-水凝膠-膜-水凝膠的順序，使用三個梯度水凝膠室和兩個PN膜制備了一個簡化模型（圖3A）。在光學(xué)照片中觀察到水凝膠室的梯度孔隙率（圖3B）。CAD與水凝膠真皮（HAD）在拉伸應(yīng)力下的對比表明，CAD的抗拉伸性遠(yuǎn)強(qiáng)于HAD。機(jī)械性能測試表明PN膜的插入有效地改善了CAD在拉伸應(yīng)力、抗斷裂性和耐縫性方面的力學(xué)性能（圖3C-F）。此外，CAD可以縫合在裸鼠的皮膚上，為全層傷口提供全面覆蓋，并緊緊附著在傷口邊緣，類似于臨床皮膚移植物（圖3G）。

圖3 復(fù)合人工真皮(CAD)的力學(xué)性能

4. 納米纖維結(jié)構(gòu)促進(jìn)細(xì)胞粘附并調(diào)節(jié)細(xì)胞形態(tài)

PN薄膜還表現(xiàn)出模擬膠原蛋白的納米纖維形態(tài)，并提供物理線索來指導(dǎo)細(xì)胞行為（圖4A）。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)說明PN薄膜提供了一個具有納米纖維形態(tài)的平臺，有利于細(xì)胞的快速粘附，并提供了模擬膠原蛋白的細(xì)胞環(huán)境（圖4B-F）。差異表達(dá)基因顯示PN薄膜的膠原模擬納米纖維通過改變轉(zhuǎn)錄基因表達(dá)和細(xì)胞形態(tài)來影響HDF的行為（圖4G-H）。  

圖4 在凝膠切片和PN薄膜上接種的HDF的行為

5. CASS的構(gòu)建

CASS由人工表皮層和人工真皮層組成。通過將兩層PN薄膜整合到封裝HDF的梯度打印水凝膠支架中來構(gòu)建人工真皮。通過將人角質(zhì)形成細(xì)胞 （HKC）接種到真皮表面形成人工表皮，并通過氣液界面孵育成熟。HDFs和HKCs分別用綠色熒光（CFDA SE）和紅色熒光（CMTPX）標(biāo)記（圖5A）。對熒光圖像的分析顯示，HKCs分布在支架表面，而HDFs分散在整個水凝膠絲中（圖5B）。CASS孵育過程的照片顯示，經(jīng)過5天的浸沒孵育和10天的氣液界面培養(yǎng)，成功制備了具有表皮層的CASS（圖5C-D）。HE、Masson染色和細(xì)胞角蛋白10（K10）熒光染色的圖像觀察到該表皮層的厚度從第5天的約20 μm增加到第15天的65 μm（圖5E）。這些發(fā)現(xiàn)共同表明了HKCs的增殖和分化，從而證實(shí)了表皮層的成功構(gòu)建。  

圖5 CASS的制造

6. 小鼠和豬的傷口愈合試驗(yàn)

首先在小鼠模型中評估了CASS治療大面積皮膚缺損的效果。傷口面積變化、HE 和 Masson 三色染色結(jié)果表明，HASS+Cell和CASS+Cell在封裝的HDF和HKC的幫助下具有更強(qiáng)的促進(jìn)傷口愈合的能力（圖6）。  

圖6 小鼠全層傷口的體內(nèi)修復(fù)

為了進(jìn)一步評估CASS在治療全層傷口中的作用，使用四只Bama小型豬作為大型動物模型。在豬背上形成12個方形全層皮膚缺損（4厘米×4厘米），用CASS+Cell處理的傷口在術(shù)后第42天表現(xiàn)出優(yōu)越的傷口愈合行為（圖7）。   

圖7 豬全層傷口的體內(nèi)修復(fù)

綜上，本文開發(fā)了一種具有梯度孔隙率和集成圖案納米纖維薄膜的3D生物打印CASS，以促進(jìn)大面積皮膚缺損的傷口愈合。CASS具有優(yōu)異的抗拉強(qiáng)度、抗斷裂性和耐縫性，并在氣液界面孵育后成功構(gòu)建了表皮。在Balb/c裸鼠和Bama小型豬模型中，CASS有效加速了大面積皮膚缺損的再生，組織學(xué)分析表明，CASS治療的傷口上皮化和膠原沉積效果更好�？傊�，3D生物打印CASS在治療大面積皮膚缺損方面具有巨大潛力，納米纖維膜在這項(xiàng)研究中的整合為構(gòu)建具有卓越機(jī)械性能和合適細(xì)胞環(huán)境的生物打印結(jié)構(gòu)提供了有益的策略。

文章來源：
https://doi.org/10.1021/acsnano.4c04088