具有增強機械強度和生物活性的 3D 生物打印組織工程骨-

來源： EngineeringForLife

大段骨缺損超出自身修復能力，常造成患者殘疾并導致生活質(zhì)量嚴重下降。為治療此類缺損，全球每年有約220萬患者接受骨移植手術(shù)，使其成為僅次于輸血的第二常見的組織移植類型。由于自體骨具有優(yōu)異的成骨誘導性、傳導性和成骨能力，且不存在疾病傳播和組織排斥問題，因此被視為骨移植的金標準。然而，其恢復率并不理想，目前大段骨缺損延遲愈合和不愈合的發(fā)生率高達10%�；加羞@些病狀的患者所承擔的費用大約是正常愈合個體的兩倍，造成了嚴重的經(jīng)濟負擔。此外，自體骨資源有限，并且在采集過程中常發(fā)生并發(fā)癥，包括疼痛、血腫和感染。因此，開發(fā)用于治療大段骨缺損的自體骨替代材料至關重要。

來自哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院的Xintao Wang團隊創(chuàng)新性地開發(fā)了新一代組織工程骨結(jié)構(gòu)，它能夠時間性調(diào)節(jié)免疫反應、平衡促炎和抗炎活動，并促進骨再生與修復，以應對大尺寸骨缺損中愈合延遲和非結(jié)合的挑戰(zhàn)。利用包括多物理場輔助聯(lián)合去細胞化、側(cè)鏈生物化學修飾和無菌凍干等創(chuàng)新技術(shù)，合成了一種新穎的光固化細胞外基質(zhì)水凝膠——甲基丙烯�；�骨源去細胞化細胞外基質(zhì)(bdECM-MA)。將bdECM-MA與硅替代的磷酸鈣和骨髓間充質(zhì)干細胞結(jié)合后，通過數(shù)字光處理3D生物打印制造出組織工程骨。該研究在體外證實，工程骨保持高細胞活性的同時，達到了MPa級別的機械強度。此外，這種工程骨展現(xiàn)出出色的成骨、成血管和免疫調(diào)節(jié)功能。免疫調(diào)節(jié)功能的分子機制之一涉及對p38-MAPK通路的抑制。首創(chuàng)性的體內(nèi)發(fā)現(xiàn)是，基于天然生物材料的組織工程骨表現(xiàn)出順序免疫調(diào)節(jié)特性，相繼激活促炎和抗炎反應，顯著加速骨缺損的修復。本研究為自體骨替代材料的研發(fā)和治療大尺寸骨缺損提供了新的研究基礎和有效方法。相關工作以題為“3D Bioprinted Tissue-Engineered Bone with Enhanced Mechanical Strength and Bioactivities: Accelerating Bone Defect Repair through Sequential Immunomodulatory Properties”的文章發(fā)表在2024年08月18日的期刊《Advanced Healthcare Materials》。   

     

【脫脂和脫礦質(zhì)的優(yōu)化與標準化】

在本研究中，bdECM-MA的制備按照詳細的順序步驟進行，從碎骨開始，然后脫脂、脫礦質(zhì)、脫細胞、研磨、消化、修飾，最后冷凍干燥。初始步驟涉及在液氮中粉碎牛骨以產(chǎn)生1×1×1 mm的未處理正常骨(NB)顆粒，為后續(xù)治療做好準備。NB顆粒的這種特定大小有助于防止由于固有組織蛋白與用于脫脂、脫礦和脫細胞的試劑之間過度接觸而引起的變性，從而促進更受控的反應。

在脫脂過程中，沒有使用有機溶劑，而是選擇了對組織生物活性影響較小的易去除的H2O2。經(jīng)過脫脂處理的骨頭(DGB)通過鹽酸法進行脫礦處理，產(chǎn)生脫脂脫礦骨(DGMB)(圖1a)。為了計算組織中的脂肪含量，本文進行了索氏提取實驗。在5克的每個骨組織中，脂肪含量僅為0.043 ± 0.006克，而在12小時的脫脂后，脂肪清除率為95.74% ± 0.57%(圖1b)。延長脫脂時間并沒有顯著提高脂肪含量和清除率。   

圖1c,d描述了DGB的脫礦過程。隨著脫礦時間的延長，X射線衍射(XRD)顯示在0小時脫礦組中出現(xiàn)的晶體HA峰值2θ為26.21(002), 32.19(211)和40.06(310)逐漸減弱，6小時后衰減明顯可見。同時，傅里葉變換紅外(FT-IR)光譜顯示，脫礦6小時后，未脫礦骨中位于1010.87、871.50、600.09和556.51 cm−1的磷酸鹽和碳酸鹽峰消失。此外，代表酰胺鍵的峰位在1628.90、1536.28和1234.74 cm−1隨脫礦時間增加呈現(xiàn)先銳后緩的趨勢，最銳利的時間點在12小時。這一現(xiàn)象表明，骨礦物質(zhì)的去除暴露了更多的內(nèi)在蛋白，這些蛋白在12小時的關鍵時期完全暴露。12小時后，由于組織長期處于酸性環(huán)境中導致蛋白質(zhì)變性，峰值變得平緩。

圖1 改良的bdECM制備流程

【bdECM的最佳消化時間】

為確定bdECM的最佳消化時間，本文分別使用染色和流變測試進行了結(jié)構(gòu)和流變學評估(圖2a)。改良的馬松三色染色(圖2b)顯示，在1天消化組中，有明顯未完全消化的大片段膠原纖維殘留以及一些紅色染色結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)代表來自脫細胞過程的殘余胞漿，可能會引發(fā)微弱的免疫反應。然而，在2天消化組中，未完全消化的膠原纖維和紅色染色結(jié)構(gòu)消失了，并且觀察到膠原纖維顯著的自我交聯(lián)，形成了一個完整的膜。在3天消化組中，雖然未觀察到未完全消化的膠原纖維和紅色染色結(jié)構(gòu)，但切片主要呈現(xiàn)碎片化和分散的模式，表明自我交聯(lián)能力降低。這些發(fā)現(xiàn)在HE染色圖像中很明顯。

圖2 bdECM-MA和Si-CaP的制備及物理性質(zhì)

【不同濃度生物墨水的生物相容性和細胞增殖活性】

在初步篩選出維持細胞活性的bdECM-MA和Si-CaP濃度后，根據(jù)濃度進行匹配和分組，最終確定了六種生物墨水：5% bdECM-MA + 0.5 mg mL−1 Si-CaP（A組），5% bdECM-MA + 1 mg mL−1 Si-CaP（B組），10% bdECM-MA + 0.5 mg mL−1 Si-CaP（C組），10% bdECM-MA + 1 mg mL−1 Si-CaP（D組），20% bdECM-MA + 0.5 mg mL−1 Si-CaP（E組），以及20% bdECM-MA + 1 mg mL−1 Si-CaP（F組）。為了評估這六組的生物相容性，本文進行了另一次CCK-8測定。結(jié)果表明：所有六組都對細胞活性有積極影響，其OD值顯著高于NC組。本文進一步研究材料濃度對細胞增殖的影響并選擇最佳濃度范圍，通過5-乙炔基-2′-脫氧尿苷(EdU)實驗進行。如圖3a所示，代表增殖細胞的紅色染色細胞在A組和B組中明顯少于其他實驗組，并且與NC組的差異不顯著。因此，5% bdECM-MA不適合理想的組織工程骨制造，因為它促進的細胞增殖非常少并且具有低機械強度。在其他具有一致bdECM-MA濃度的實驗組中，C組和E組的紅色染色細胞少于D組和F組。根據(jù)本研究團隊之前的研究，將這種現(xiàn)象歸因于1 mg mL−1的Si-CaP的強大成骨誘導性，它顯著促進了BMSC分化為成骨細胞，從而減少了它們的增殖活性。   

圖3 3D生物打印初始支架的制備、表征及組分濃度測定

【成骨活性】

組織工程骨與骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)共培養(yǎng)(圖4a)。通過染色圖像定性檢測成骨分化的早期標志物堿性磷酸酶(ALP)。代表ALP表達的藍色染色程度從NC組到E組、Si組和SE組逐漸增強(圖4b)，統(tǒng)計分析確認各組間存在顯著差異(圖4c)。這一趨勢在茜素紅S(ARS)染色中更加明顯(圖4d)，SE組中的ARS表達量是NC組的七倍(圖4e)。   

圖4 3D生物打印新型組織工程骨的成骨活性評估

【血管生成活性】

本文分離了大鼠主動脈內(nèi)皮細胞(RAOECs)并將它們與本實驗中的組織工程骨共培養(yǎng)(圖5a)。CD31免疫熒光染色顯示，提取的細胞呈扁平多邊形，且強烈表達CD31，證實它們是原代RAOEC(圖5b)。為了評估組織工程骨的血管生成活性，本文進行了管形成實驗。如圖5c所示，SE組顯示出比其他三組更強的管形成能力，E組的表現(xiàn)優(yōu)于Si組，而Si組則優(yōu)于NC組。然而，觀察研究與隨后的統(tǒng)計分析之間存在差異。盡管SE組和Si組的管數(shù)、總管面積和總管長度均顯著高于NC組，但NC組和E組之間沒有觀察到顯著的統(tǒng)計學差異(圖5d)。進一步分析圖5c顯示，E組的管壁明顯更厚，細胞數(shù)量更多，表明bdECM-MA促進了RAOEC的增殖。在管壁較厚、同一視野內(nèi)細胞數(shù)量較多的組中，管數(shù)、總管面積和總管長度預計會減少。

圖5 3D生物打印新型組織工程骨中血管生成活性的評估

【免疫調(diào)節(jié)特性】   

為評估組織工程骨的免疫調(diào)節(jié)特性，本文從大鼠外周血中提取單核細胞并誘導其分化為巨噬細胞。提取的細胞呈圓形或橢圓形，細胞體無定形，胞質(zhì)相對均勻。流式細胞分析顯示，94.5%的細胞表達M0巨噬細胞表面標志物CD68和CD11b，確認成功提取并誘導了大鼠M0巨噬細胞。隨后，使用脂多糖(LPS)將M0巨噬細胞誘導為M1巨噬細胞，誘導后與組織工程骨共培養(yǎng)(圖6a)。WB和qPCR分析顯示，在NC組中，經(jīng)過LPS處理后，隨著時間的增加，促炎介質(zhì)(iNOS, TNF-α)的相對表達水平略有增加，其中細胞主要表現(xiàn)出M1表型(圖6b-d)。在三個實驗組中，盡管第一天沒有觀察到明顯的促炎介質(zhì)表達減少，但隨著時間的推移記錄到了逐漸減少，第三天效果最為顯著。促炎介質(zhì)表達水平的降低在SE組中最為顯著，而與E組相比，Si組對促炎反應的抑制更為明顯。關于抗炎介質(zhì)(ARG-1, IL-10)的表達，在關鍵的第三天觀察到顯著差異，SE組顯示出最強的效果(圖6b-f)。  

圖6 3D生物打印新型組織工程骨中免疫調(diào)節(jié)特性的評估

【免疫調(diào)節(jié)特性的分子機制初步探索】

為探索免疫調(diào)節(jié)特性的具體機制，對共培養(yǎng)三天的細胞進行了基因測序�；鹕綀D(圖7a-c,e)和復雜熱圖(圖7b-d,f)顯示了組間基因表達的顯著差異。隨后，通過將每組的差異表達基因與潛在的巨噬細胞靶點相交，并構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡，篩選出按度值排名的前100個靶點進行后續(xù)富集分析。從圖7g-i可以看出，三組的基因本體（GO）富集分析顯示，“炎癥反應”和“免疫反應”在生物過程術(shù)語中顯著富集；“胞漿、細胞外空間、分泌、細胞外基質(zhì)和細胞表面”在細胞組分術(shù)語中富集；“生長因子和細胞因子”在分子功能術(shù)語中富集。此外，KEGG通路分析表明，“TNF、IL-17和Toll樣受體信號通路”在所有實驗組中都得到了富集。   

圖7 組織工程骨中免疫調(diào)節(jié)特性機制的初步探索

【揭示并分析組織工程骨在體內(nèi)的順序性免疫調(diào)節(jié)性能】

為了進一步研究組織工程骨的免疫調(diào)節(jié)性能，本文進行了體內(nèi)實驗。分別構(gòu)建了NC(未植入組)、G組(3D生物打印的GelMA支架)、GB組(3D生物打印嵌入BMSCs的GelMA組織工程骨)、EB組(3D生物打印嵌入BMSCs的bdECM-MA組織工程骨)、GSiB組(3D生物打印嵌入BMSCs的GelMA/Si-CaP組織工程骨)和ESiB組(3D生物打印嵌入BMSCs的bdECM-MA/Si-CaP組織工程骨)(圖8a)。將支架和組織工程骨植入到具有關鍵大小顱骨缺損的大鼠模型中(圖8b)。   

圖8 組織工程骨中iNOS的動物模型構(gòu)建及免疫調(diào)節(jié)特性的組織學分析

在植入后的第1、2、3周，分別對M1和M2巨噬細胞標志物iNOS和CD163進行免疫熒光染色，以評估不同組別中M1和M2巨噬細胞的募集水平(圖8c和9a)。同時，在第二周和第三周，EB、GSiB和ESiB組的iNOS熒光強度明顯低于G組和GB組，表明EB、GSiB和ESiB組對持續(xù)炎癥反應的抑制作用(圖8d)。在第一周，含有bdECM-MA的EB和ESiB組顯示出更強的iNOS熒光強度，趨勢為ESiB > EB > G > GSiB > GB > NC(圖8d)。同時，與其他組相比，EB、GSiB和ESiB組的CD163熒光強度適度增加(圖9b)。此外，在第二周觀察到更明顯的趨勢，ESiB > GSiB和EB > GB、G和NC，而在第三周，CD163的表達趨勢轉(zhuǎn)變?yōu)镋SiB、GSiB和EB > GB、G和NC(圖9b)。隨著時間的推移，NC、G和GB組的iNOS熒光強度逐漸增加，而EB、GSiB和ESiB組的iNOS熒光強度逐漸降低(圖8e)。在NC、G和GB組中，CD163熒光強度較低，而在EB和ESiB組中，CD163熒光強度依次降低，第二周 > 第三周 > 第一周(圖9c)。在GSiB組中，CD163熒光強度保持持續(xù)高表達，在第一周、第二周和第三周之間沒有顯著差異(圖9c)。然而，在體外實驗中，特別是在SE組中，促炎介質(zhì)的表達在早期并未觀察到組間的顯著差異，其表達量并不高于NC組。此外，抗炎介質(zhì)在早期并未表現(xiàn)出表達增加，隨后隨時間降低的趨勢，特別是在EB和ESiB組中。

圖9 組織工程骨中CD163的免疫調(diào)節(jié)特性組織學分析

圖10 組織工程骨的體內(nèi)血管生成與成骨作用

【總結(jié)與展望】
本文開發(fā)了一種具有高細胞活性和優(yōu)異機械強度的新型組織工程骨，能夠通過順序免疫調(diào)節(jié)顯著刺激骨再生。該組織工程骨是通過將Si-CaP和BMSCs結(jié)合到bdECM-MA中，利用一系列創(chuàng)新技術(shù)合成，并通過DLP生物打印制造的。通過材料間的靜電排斥作用，組織工程骨實現(xiàn)了MPa級別的機械強度，同時保持了高細胞活性。此外，由于bdECM-MA和Si-CaP的協(xié)同作用，該工程骨展現(xiàn)出了出色的成骨和成血管活性以及增強的免疫調(diào)節(jié)能力。促成成骨和成血管活性的分子機制涉及TLR4–PI3K–AKT通路的激活，從而促進成骨-成血管耦合。免疫調(diào)節(jié)功能的分子機制之一涉及對p38-MAPK通路的抑制。本研究的一個首創(chuàng)性發(fā)現(xiàn)是組織工程骨的免疫調(diào)節(jié)特性，即順序激活促炎和抗炎反應。據(jù)我們所知，這是首次在基于天然生物材料的組織工程骨中展示這一特性。得益于其出色的成骨和成血管活性以及順序免疫調(diào)節(jié)特性，新型組織工程骨顯著加速了大尺寸骨缺損的愈合。盡管具體的分子機制仍需進一步研究，但本研究獲得的見解為組織工程和骨免疫調(diào)節(jié)領域的持續(xù)討論提供了有價值的視角。   


文章來源：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adhm.202401919