《Biomaterials》：3D打印具有肝臟細(xì)胞和靜脈結(jié)構(gòu)的肝臟類器官

來源：上海醫(yī)豆

當(dāng)代醫(yī)學(xué)研究的前沿，3D生物打印技術(shù)正以其革命性的潛力，重塑我們對器官再生和移植的認(rèn)知。

肝臟作為人體的重要器官，具有復(fù)雜的生理功能，包括代謝、解毒、合成蛋白質(zhì)等。然而，傳統(tǒng)的3D打印技術(shù)在打印具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)和功能的肝臟組織方面存在諸多挑戰(zhàn)。為了克服這些挑戰(zhàn)，科學(xué)家們一直在探索新的打印技術(shù)和材料。

最近，北京協(xié)和醫(yī)院肝臟外科教授毛一雷、楊華瑜團(tuán)隊攜手牛津大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程研究所/牛津大學(xué)高等研究院 (蘇州) 葉華團(tuán)隊、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所/天津醫(yī)學(xué)健康研究院黃鵬羽團(tuán)隊，在《Biomaterials》期刊上發(fā)表了他們的開創(chuàng)性研究。

研究團(tuán)隊開發(fā)了一種名為“全方位打印嵌入式網(wǎng)絡(luò)（OPEN）”的新型支撐介質(zhì)，成功打印出具有肝臟細(xì)胞和靜脈結(jié)構(gòu)的肝臟類器官（HEALs），HEALs在移植后顯著促進(jìn)了內(nèi)源性血管新生，這對于提高移植器官的存活率和功能恢復(fù)具有重要意義。

合成方法：

1、支撐介質(zhì)OPEN的制備：

研究者開發(fā)了一種新型的支撐介質(zhì)OPEN，利用Pluronic® F-127 (PF127) 和改性羥丙甲纖維素 (H-HPMC) 通過疏水作用形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。通過調(diào)整PF127和H-HPMC的比例，優(yōu)化了OPEN的流變學(xué)特性，確保其在室溫到體溫范圍內(nèi)具有穩(wěn)定的固體特性和可調(diào)節(jié)的模量。

2、細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

從小鼠中分離出主要肝細(xì)胞（PMHs），并采用特定的培養(yǎng)基誘導(dǎo)其形成肝細(xì)胞球體。同時培養(yǎng)了內(nèi)皮細(xì)胞系C166，用于后續(xù)的血管結(jié)構(gòu)打印。

3、生物墨水的制備

將GelMA（一種光交聯(lián)的膠原蛋白類似物）與細(xì)胞混合，形成適合3D打印的生物墨水。根據(jù)打印需要，調(diào)整了GelMA、光引發(fā)劑LAP以及細(xì)胞的濃度。

4、3D打印

使用3D打印機(jī)（BioMaker 2, SunP Biotech）進(jìn)行打印，打印機(jī)和打印床的溫度分別設(shè)置為20°C和30°C。打印路徑根據(jù)肝臟解剖學(xué)設(shè)計，采用格子狀和圓形路徑分別打印肝臟實質(zhì)和血管結(jié)構(gòu)。

5、打印后處理

打印完成后，使用紫外線照射固定打印結(jié)構(gòu)。將打印結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)移到含有α-CD（一種有效的去除劑）的溶液中，以去除OPEN支撐介質(zhì)。

體外表征：

A. 通過特定的培養(yǎng)條件，肝細(xì)胞能夠自發(fā)聚集形成球體，這是模擬肝臟自然結(jié)構(gòu)的重要步驟。B. 活/死染色實驗顯示，在體外培養(yǎng)10天后，肝細(xì)胞的存活率超過90%，21天后存活率仍高于80%。這表明打印的肝細(xì)胞在體外環(huán)境中具有較高的生存能力。C. 共聚焦圖像顯示肝細(xì)胞球體具有典型的多邊形形態(tài)，這是功能性肝細(xì)胞的特征之一。D. 通過免疫熒光染色檢測了肝細(xì)胞球體中特定肝細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)，如白蛋白（ALB）和α1-抗胰蛋白酶（AAT）。肝細(xì)胞球體在培養(yǎng)10天后顯示出高ALB和AAT的熒光，表明它們具有肝臟功能。E. 糖原儲存的PAS染色結(jié)果顯示肝細(xì)胞球體能夠儲存糖原，這是肝細(xì)胞正常功能的重要指標(biāo)。F. 低密度脂蛋白攝取的Dil-ac-LDL熒染色結(jié)果表明肝細(xì)胞球體能夠攝取并儲存低密度脂蛋白，進(jìn)一步證實了它們的肝臟功能。G. ICG攝取和釋放實驗顯示肝細(xì)胞球體能夠在6小時內(nèi)攝取并釋放ICG，表明它們具有正常的肝臟代謝功能。H. 通過定量實時聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）分析了肝細(xì)胞球體中肝細(xì)胞特異性基因的表達(dá)。與新鮮分離的PMHs相比，HEAL中的PMHs在10天培養(yǎng)后，ALB和AAT基因表達(dá)水平為新鮮PMHs的40%，而Fpn、Krt8和Krt18等其他肝細(xì)胞標(biāo)記基因在HEAL中的表達(dá)水平顯著高于2D和3D培養(yǎng)條件，表明HEAL中的肝細(xì)胞球體具有更好的肝功能。I. 主成分分析（PCA）結(jié)果顯示，HEAL樣本的基因表達(dá)模式與新鮮分離的PMHs相似，表明HEAL中的肝細(xì)胞球體在基因表達(dá)水平上更接近于自然肝細(xì)胞。J. 基因表達(dá)熱圖展示了與肝發(fā)育和肝形態(tài)發(fā)生相關(guān)的基因在PMHs、HEAL、2D和3D培養(yǎng)條件下的表達(dá)熱圖。熱圖顯示HEAL中的肝細(xì)胞球體在關(guān)鍵肝細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子和代謝相關(guān)基因的表達(dá)上與新鮮PMHs相似，而2D和3D培養(yǎng)條件下的PMHs則表現(xiàn)出顯著差異。

體內(nèi)移植后新生血管情況

A. 新生血管的示意圖展示了通過保留肝細(xì)胞球體裝載層之間的空隙促進(jìn)內(nèi)源性新生血管。這種設(shè)計利用了打印結(jié)構(gòu)中的空隙，為血管新生提供了空間，從而有助于血管從宿主組織向移植的肝臟組織生長。B. 移植后血管化的HEAL的明場圖像展示了移植后14天的血管化HEAL的明場圖像，顯示了在打印格子結(jié)構(gòu)的自由空間上的血管生成。圖像顯示了在HEAL結(jié)構(gòu)中形成了豐富的血管網(wǎng)絡(luò)，這表明移植的肝臟組織能夠與宿主的血管系統(tǒng)相連，從而獲得必要的營養(yǎng)和氧氣。C. 通過尾部注射熒光地克司藍(lán)，展示了功能性新血管。熒光圖像清晰顯示了新形成的血管網(wǎng)絡(luò)，證明了這些血管是功能性的，能夠運(yùn)輸血液和營養(yǎng)物質(zhì)。D. AAT陽性移植部分的新血管熒光圖像展示了在AAT（α1-抗胰蛋白酶）陽性移植部分上的新血管的熒光圖像。AAT是一種肝臟特異性蛋白，其陽性區(qū)域表明這些新血管與肝臟組織相連，進(jìn)一步證實了血管新生的成功。E. 血管密度和總血管長度的定量展示了有無靜脈結(jié)構(gòu)的HEAL的血管密度和總血管長度的定量結(jié)果。數(shù)據(jù)表明，包含靜脈結(jié)構(gòu)的HEAL在平均血管密度和總血管長度上均顯著高于僅打印肝臟結(jié)構(gòu)的HEAL，這表明靜脈結(jié)構(gòu)的引入顯著促進(jìn)了血管新生。F-G. 肝細(xì)胞和血管標(biāo)記物的共聚焦圖像顯示了肝細(xì)胞和新血管的共存，表明這些新血管不僅形成了，而且與肝臟細(xì)胞緊密相連，這對于肝臟功能的維持至關(guān)重要。H. 血管標(biāo)記物CD31的共聚焦圖像展示了在血管標(biāo)記物CD31陽性移植組分上的新血管的共聚焦圖像。CD31是一種內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物，其陽性區(qū)域表明新血管的形成是由內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移驅(qū)動的。I.通過CD31和ALB免疫組化染色，確認(rèn)了移植后2周內(nèi)HEAL中維持的肝臟功能和顯著的新生血管。免疫組化染色結(jié)果進(jìn)一步證實了HEAL在移植后不僅保持了肝臟功能，還成功促進(jìn)了血管新生，這對于移植肝臟的長期存活和功能至關(guān)重要。

結(jié)論

研究結(jié)果表明，利用OPEN和生物墨水打印的HEALs不僅在體外具有生物活性，而且在體內(nèi)移植后能夠促進(jìn)血管新生，維持肝臟功能。這為肝臟疾病治療和器官移植提供了新的治療方法。

盡管取得了顯著進(jìn)展，但研究者也指出，HEALs的結(jié)構(gòu)和功能與真實肝臟相比仍有差距。未來的研究需要進(jìn)一步優(yōu)化打印技術(shù)、生物墨水和多細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)，以更好地模擬肝臟的微環(huán)境和功能。


文獻(xiàn)：Zhuoran Jiang, Bao Jin, Zhu Liang, Yinhan Wang, Shuai Ren, Yongfa Huang, Changcan Li, Hang Sun, Yunzhu Li, Li Liu, Nianlin Li, Jinzhuo Wang, Zhanfeng Cui, Pengyu Huang, Huayu Yang, Yilei Mao, Hua Ye,Liver bioprinting within a novel support medium with functionalized spheroids, hepatic vein structures, and enhanced post-transplantation vascularization,Biomaterials