GelMA 3D打印水凝膠異步藥物輸送系統(tǒng)用于腦膠質(zhì)瘤術(shù)后防復(fù)發(fā)和神經(jīng)再生

多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（Glioblastoma Multiforme，GBM）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的腫瘤、其惡性程度最高，預(yù)后極差。盡管接受標(biāo)準(zhǔn)的手術(shù)切除聯(lián)合放療和化療可顯著增加患者生存，但經(jīng)過聯(lián)合治療的患者依然面臨兩個(gè)主要問題：一是由于GBM的高度浸潤(rùn)性造成手術(shù)切除后微小的腫瘤組織灶殘留，因此GBM的復(fù)發(fā)率極高；并且復(fù)發(fā)GBM的生長(zhǎng)速度更快，侵襲性更強(qiáng)，對(duì)治療的反應(yīng)性更低，嚴(yán)重威脅患者的生存。二是手術(shù)切除對(duì)神經(jīng)組織的損傷亦嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量。因此，了解GBM復(fù)發(fā)和惡性轉(zhuǎn)化的潛在分子機(jī)制、尋找合適的治療靶點(diǎn)、開發(fā)理想的給藥系統(tǒng)在預(yù)防GBM復(fù)發(fā)及改善神經(jīng)損傷方面具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。

鑒于此，廣州醫(yī)科大學(xué)姚茂金/暨南大學(xué)郭瑞/華南理工大學(xué)任嬌艷合作開發(fā)了一種3D異步藥物輸送系統(tǒng)來應(yīng)對(duì)GBM復(fù)發(fā)和術(shù)后神經(jīng)功能缺損的雙重挑戰(zhàn)�；�于小鼠原發(fā)性和復(fù)發(fā)性GBM組織之間腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境 (TME) 細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組分析，開發(fā)了一種新的雙靶向方法，將mTOR通路抑制與小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞復(fù)極相結(jié)合。然后，構(gòu)建了原位可注射的甲基丙烯酸酯明膠 (GelMA)，使其完美貼合腫瘤切除腔并實(shí)現(xiàn)雙靶向藥物的直接輸送，在體內(nèi)表現(xiàn)出出色的術(shù)后GBM抑制效果。同時(shí)，利用神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子浸潤(rùn)的 3D打�。ㄊ褂肊FL-BP8601P光固化生物3D打印機(jī)） GelMA補(bǔ)片構(gòu)建了3D異步藥物輸送系統(tǒng)（GelMA/TPNB），使神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子逐漸滲透到下層的水凝膠中以促進(jìn)神經(jīng)軸突出芽。值得注意的是，該3D異步給藥系統(tǒng)在促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)的同時(shí)，不影響抑制腫瘤復(fù)發(fā)的療效。基于此，本研究不僅提出了一種新的雙靶向GBM治療策略，而且開創(chuàng)性地構(gòu)建了3D異步給藥系統(tǒng)用于GBM的綜合治療，有望改善GBM患者的不良預(yù)后。該工作近期發(fā)表在發(fā)表在《Advanced Functional Materials》期刊（doi/10.1002/adfm.202401383）。該論文的通訊作者為廣州醫(yī)科大學(xué)姚茂金教授、暨南大學(xué)郭瑞研究員和華南理工大學(xué)任嬌艷教授。廣州醫(yī)科大學(xué)博士研究生胡洋、暨南大學(xué)碩士生周莉明和南方醫(yī)科大學(xué)附屬第十醫(yī)院（東莞市人民醫(yī)院）王振寧博士為該論文的共同第一作者。

圖1 組裝嵌入式 3D 水凝膠系統(tǒng)（GelMA/TPNB）用于異步藥物輸送以抑制惡性膠質(zhì)瘤術(shù)后復(fù)發(fā)并促進(jìn)神經(jīng)恢復(fù)

本研究在小鼠上建立復(fù)發(fā)GBM模型，以模擬人膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)過程。通過對(duì)人源的腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的DEGs進(jìn)行GO和KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)與原發(fā)膠質(zhì)瘤比較，復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤中與EMT相關(guān)的基因表達(dá)升高。接下來，該研究團(tuán)隊(duì)深入分析了促進(jìn)膠質(zhì)瘤的侵襲、遷移能力以及血管生成能力的分子基礎(chǔ)并發(fā)性發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)性 GBM 腫瘤細(xì)胞中mTOR信號(hào)通路基因表達(dá)上調(diào)。接著，該研究團(tuán)隊(duì)通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了mTOR抑制劑替西羅莫司（Temsirolimus）能有效的抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖。此外，惡性膠質(zhì)瘤的另一重要標(biāo)志是難以抑制的腫瘤免疫微環(huán)境（TME）。通過對(duì)鼠源的腫瘤微環(huán)境細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析和人源的原發(fā)膠質(zhì)瘤與復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，該研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)與原發(fā)膠質(zhì)瘤相比，復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞 (TAMs) 的表型由原來的促炎型（M1）轉(zhuǎn)變?yōu)榭寡仔停∕2）。接著，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和數(shù)據(jù)庫單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示CSF-1/CSF-1R在復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤中高表達(dá)。因此，該研究團(tuán)隊(duì)選擇PLX5622，一種選擇性CSF-1R抑制劑，以重塑腫瘤微環(huán)境抑制腫瘤的免疫逃逸和生長(zhǎng)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PLX5622能有效清除小鼠大腦中的小膠質(zhì)細(xì)胞。綜合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)的分析結(jié)果，該研究團(tuán)隊(duì)找到了治療復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤潛在的雙重靶點(diǎn)，即mTOR復(fù)合物及CSF-1/CSF-1R信號(hào)，可以同時(shí)靶向腫瘤細(xì)胞和免疫微環(huán)境細(xì)胞。雙重靶點(diǎn)能夠有效的解決單靶向藥物無法充分阻斷腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、擴(kuò)散和易產(chǎn)生耐藥性的問題。

圖2 原發(fā)性GBM與復(fù)發(fā)性GBM腫瘤細(xì)胞中差異表達(dá)基因的生物信息學(xué)分析

圖3 原發(fā)性GBM與復(fù)發(fā)性GBM TME中差異表達(dá)基因的生物信息學(xué)分析

鑒于常規(guī)的抑制劑給藥方式帶來嚴(yán)重的副作用和腦部血腦屏障對(duì)藥物遞送的阻礙，該研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種具有生物相容性的甲基丙烯酸酯改性明膠 (GelMA) 可注射水凝膠以完美貼合膠質(zhì)瘤切除術(shù)后的不規(guī)則腔體。為了避免異物反應(yīng)，該研究團(tuán)隊(duì)選擇使用低溶脹性的 10% 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的 GelMA 作為腦部藥物遞送載體，并且具有與天然腦組織相似的機(jī)械強(qiáng)度和生物降解性。該研究團(tuán)隊(duì)結(jié)合開發(fā)的新型雙靶向療法制備了載有PLX5622和Temsirolimus的10% GelMA水凝膠（GelMA/TP），以對(duì)腫瘤細(xì)胞及其生長(zhǎng)的微環(huán)境產(chǎn)生協(xié)同抑制作用。

圖4 3D異步藥物遞送系統(tǒng)的構(gòu)建和表征

我們利用裸鼠建立了GBM術(shù)后切除模型以評(píng)估GelMA/TP水凝膠抑制GBM復(fù)發(fā)的功效。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GelMA/TP顯著提高了裸鼠的總體生存率，超過 50% 的小鼠在切除后 120 天內(nèi)仍然存活。H&E染色結(jié)果顯示GelMA/TP治療后切除腔內(nèi)的腫瘤細(xì)胞明顯減少。免疫熒光染色結(jié)果顯示GelMA/TP 治療的小鼠的腦組織中觀察到大量 BrdU 陽性細(xì)胞和少量的Ki67陽性細(xì)胞，表明了GelMA/TP有效抑制了切除后殘留腫瘤細(xì)胞的增殖。此外，GelMA/TP 組的磷酸化 S6 核糖體蛋白 (RPS6)明顯減少，mTOR 通路基因的表達(dá)水平顯著下降且血管生成減少。此外，GelMA/TP 組中 IBA1 陽性細(xì)胞的存在明顯減少且M2 表型相關(guān)的標(biāo)志物下調(diào)。這些結(jié)果表明 GelMA/TP 治療調(diào)節(jié)了TME以阻止腫瘤進(jìn)展并減輕神經(jīng)膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)。同時(shí)，GelMA/TP水凝膠在植入腦內(nèi)121天后完全降解且外周器官的H&E染色結(jié)果并未呈現(xiàn)異常病變，表明了該水凝膠系統(tǒng)的生物降解性和生物相容性。

圖5 GelMA/TP顯著抑制了腫瘤復(fù)發(fā)并延長(zhǎng)了切除后 GBM 小鼠的生存期

圖6 GelMA/TP對(duì)于 mTOR 通路和 TME 的調(diào)節(jié)在GBM治療中

為了解決 GBM 手術(shù)后的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，該研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了一個(gè)載有BDNF 和 NGF 的 3D 打印 GelMA 補(bǔ)片。受海綿結(jié)構(gòu)的啟發(fā)，該研究團(tuán)隊(duì)通過立體光刻 3D 打印技術(shù)制備了具有大孔結(jié)構(gòu)的 GelMA 水凝膠補(bǔ)片，并將神經(jīng)生長(zhǎng)因子 (NGF) 和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子 (BDNF) 滴在凍干貼片上以制備因子浸潤(rùn)的海綿載體。接著，載有因子的海綿被放置在 GelMA 植入材料上，使神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子緩慢向下擴(kuò)散。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這種新型 3D 藥物輸送系統(tǒng)可有效促進(jìn)軸突發(fā)芽潛力，同時(shí)并不阻礙 GBM 的治療功效。

圖7 GelMA/TPNB治療后小鼠腦組織中的軸突發(fā)芽和抑制GBM的功效

文章來源：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adfm.202401383