3D打印可被超聲激振的生物支架加速骨再生

來(lái)源： EFL生物3D打印與生物制造

物理刺激對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用顯示出調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能的潛力，包括遷移、分化和存活。然而，這些體外模型在體內(nèi)外實(shí)際的應(yīng)用潛力取決于物理刺激是否可以外用，而無(wú)需侵入性的刺激手段。針對(duì)這一要求，荷蘭馬斯特里赫特大學(xué)梅林技術(shù)啟發(fā)再生醫(yī)學(xué)研究所的Lorenzo Moroni教授團(tuán)隊(duì)提出了一種3D打印的動(dòng)態(tài)雙面支架，該支架可用外部超聲波激活納米振動(dòng)，并傳遞到周圍的細(xì)胞，調(diào)控細(xì)胞功能性表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)骨再生，相關(guān)工作“Janus 3D printed dynamic scaffolds for nanovibration-driven bone regeneration” 發(fā)表在Nature Communication雜志上。研究人員調(diào)控可生物降解的聚己內(nèi)酯（PCL）和聚乳酸（PLA）共混物中的相對(duì)比例，通過(guò)相分離自發(fā)形成雙面結(jié)構(gòu)（圖1），利用3D打印技術(shù)制備所需宏觀三維結(jié)構(gòu)，由于PCL和PLA不同的生物相容性和聲學(xué)響應(yīng)性分別作為背襯材料和活性材料，從而形成一個(gè)超聲換能器（超聲到機(jī)械振動(dòng)）。這樣就可以實(shí)現(xiàn)非接觸式物理刺激的感應(yīng)與傳遞，將超聲的聲頻轉(zhuǎn)變?yōu)橹Ъ艿臋C(jī)械撓度形變，從而影響細(xì)胞增殖、分化以及蛋白表達(dá)等行為。該研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)超聲刺激的支架表面的細(xì)胞表現(xiàn)出更顯著的成骨分化，具有更高的成骨標(biāo)志物表達(dá)和更高的基質(zhì)蛋白I型膠原和纖維連接蛋白沉積。另外，研究人員還發(fā)現(xiàn)這種分化增強(qiáng)與細(xì)胞上的電位門控鈣離子通道的形成增強(qiáng)以及進(jìn)一步激活有關(guān)。

圖1 雙面結(jié)構(gòu)的3D打印制備過(guò)程

在支架的制備過(guò)程中，研究人員首先選擇了兩種廣泛使用的可生物降解和生物相容性的聚合物--聚已內(nèi)酯(PCL)和聚乳酸(PLA)，按照一定的比例將其混合制成纖維狀顆粒，再通過(guò)熔融沉積3D打印的方式，將材料擠出打印成支架結(jié)構(gòu)。由于PCL和PLA之間沒(méi)有良好的相互作用，因此他們不互溶，形成分離的兩相，該過(guò)程出于材料本身的性質(zhì)，故能自發(fā)形成。通過(guò)調(diào)節(jié)PCL和PLA的相對(duì)比例，研究人員發(fā)現(xiàn)，當(dāng)PCL和PLA以1：1的比例混合時(shí)，打印的支架結(jié)構(gòu)纖維內(nèi)部可以看到明顯的相分離界面，兩相可以較為清楚和獨(dú)立地分開(kāi)，如圖1b所示。

為了使打印的支架雙面結(jié)構(gòu)化身為可超聲激活的動(dòng)態(tài)機(jī)械支架，研究人員選擇了不同頻率的超聲波來(lái)評(píng)估不同組分（Janus，PCL，PLA）支架的最佳偏轉(zhuǎn)，以觸發(fā)細(xì)胞反應(yīng)，如圖2所示。結(jié)果顯示，聲波的偏轉(zhuǎn)在較高聲頻和較軟的材料下減弱，PCL相較PLA質(zhì)地更軟。而單獨(dú)分析這些材料時(shí)，較低的偏轉(zhuǎn)振幅(較高的頻率)導(dǎo)致了相對(duì)于未受刺激培養(yǎng)的更高的增殖。

圖2 超聲波遠(yuǎn)程驅(qū)動(dòng)支架結(jié)構(gòu)的微納振動(dòng)以及對(duì)細(xì)胞行為的影響

為了評(píng)估外部超聲刺激3D打印支架實(shí)現(xiàn)骨再生的潛力，我們?cè)贘anus、PCL和PLA支架上培養(yǎng)hBMSCs 21天，在成骨培養(yǎng)基中，靜態(tài)(0 kHz)和刺激(40 kHz, 30分鐘/天)條件下。培養(yǎng)21天后，在受刺激的Janus支架上形成致密的I型膠原網(wǎng)絡(luò)(圖3a)，而受刺激的PCL、PLA或任何靜態(tài)培養(yǎng)條件只顯示細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。與刺激PLA或任何靜態(tài)條件相比，在受刺激的Janus和PCL材料上培養(yǎng)的細(xì)胞上，在基因水平上也檢測(cè)到了I型膠原、RunX2和骨鈣素的上調(diào)(圖3b)，而在Janus支架上的上調(diào)更為明顯。此外，Janus支架上沉積的礦物呈圓形多孔形態(tài)，這通常屬于無(wú)定形羥基磷灰石或磷酸鈣。在骨礦化過(guò)程中，無(wú)定形和球形的磷酸鈣礦化形成碳酸化羥基磷灰石，這表明Janus支架具有骨形成潛能（圖3d）。ATP釋放是機(jī)械刺激下成骨細(xì)胞反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在受刺激的Janus支架上培養(yǎng)的hBMSCs比其他任何受刺激或靜態(tài)條件下培養(yǎng)的hBMSCs高4倍。在MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化過(guò)程中，在2D間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，在直接低強(qiáng)度超聲刺激下，ATP釋放增加，并導(dǎo)致細(xì)胞膜去極化，這與我們?cè)谶@里觀察到的結(jié)果一致(圖3)。

圖3 Janus支架在遠(yuǎn)程超聲刺激下促進(jìn)hBMSCs成骨分化

細(xì)胞膜去極化，作為機(jī)械刺激的結(jié)果，導(dǎo)致電位門控鈣離子通道(VGCC)的激活，以調(diào)節(jié)鈣流入細(xì)胞。為了確定L-VGCCs是否參與成骨分化，我們?cè)u(píng)估了編碼L-VGCC亞基Cav1.2的CACNA1c基因的表達(dá);我們發(fā)現(xiàn)CACNA 1c在受刺激的Janus支架上上調(diào)了3倍，而在受刺激的PCL或PLA支架上則沒(méi)有上調(diào)(圖4a)。在分化過(guò)程中，用硝苯地平阻斷L-VGCC，發(fā)現(xiàn)材料和培養(yǎng)條件下都導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量減少，但在刺激條件下更明顯。阻斷L-VGCC還導(dǎo)致I型膠原、RunX2和骨鈣素基因表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致刺激和靜態(tài)培養(yǎng)條件下無(wú)顯著差異(圖5d)。因此，當(dāng)LVGCC被阻斷時(shí)，超聲刺激不再影響細(xì)胞的分化或增殖，證明了二者的直接相關(guān)性。

綜上，該研究提出了一種外部超聲波遠(yuǎn)程控制支架動(dòng)態(tài)振動(dòng)以誘導(dǎo)細(xì)胞行為的方案，PCL和PLA支架分別以阻尼材料和偏轉(zhuǎn)材料的形式響應(yīng)超聲，而這兩種材料的組合將導(dǎo)致更短的脈沖寬度和更小的偏轉(zhuǎn)。Janus支架的刺激會(huì)增加hBMSCs的細(xì)胞增殖，以及成骨標(biāo)志物的表達(dá)和沉積。因此，遠(yuǎn)程激活Janus支架是傳統(tǒng)靜態(tài)植入的理想選擇，可以提供細(xì)胞的指令刺激，該研究展示了體外模型在植入體內(nèi)接受外部刺激的應(yīng)用潛力。

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https://doi.org/10.1038/s41467-021-21325-x