雙重交聯(lián)海藻酸鹽基熱響應(yīng)水凝膠作為3D打印生物墨水用于細(xì)胞球狀體生長和釋放

來源： GK綠鑰生物科技

帕特雷大學(xué)化學(xué)工程系George Pasparakis教授團隊在《Carbohydrate Polymers》期刊上發(fā)表文章“Dually crosslinked injectable alginate-based graft copolymer thermoresponsive hydrogels as 3D printing bioinks for cell spheroid growth and release”，作者研究團隊在這項研究中開發(fā)了一種基于海藻酸鈉接枝共聚物的雙交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，具有聚(n-異丙基丙烯酰胺-co-n-叔丁基丙烯酰胺)P(NIPAM-co-NtBAM)側(cè)鏈，并對其作為一種剪切稀釋軟凝膠生物鏈接進行了研究。提出的生物墨水可以在溫和的3D打印條件下形成任意幾何形狀。研究人員證明了所開發(fā)的生物墨水可以進一步用作生物打印墨水，并展示了其促進人類骨膜衍生細(xì)胞(hPDCs)在3D環(huán)境下生長和形成3D球體的能力。總之，由于生物鏈接具有熱逆轉(zhuǎn)其聚合物網(wǎng)絡(luò)交聯(lián)的能力，因此可以進一步用于細(xì)胞球體的快速恢復(fù)，這意味著它具有作為細(xì)胞球體形成模板的潛在用途，可用于3D生物制造。

WHAT—什么是雙重交聯(lián)注射型熱響應(yīng)水凝膠？

雙重交聯(lián)注射型熱響應(yīng)水凝膠是一種先進的生物材料，它結(jié)合了兩種交聯(lián)方式：物理交聯(lián)（如離子交聯(lián)）和化學(xué)交聯(lián)（如熱響應(yīng)性疏水相互作用），使其具備在特定溫度下可逆變化的特性。這種水凝膠設(shè)計為可注射，能夠在體內(nèi)或體外通過改變溫度來調(diào)節(jié)其物理狀態(tài)，從而在3D生物打印、藥物遞送、組織工程等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用潛力。

WHY—為什么采用雙重交聯(lián)注射型熱響應(yīng)水凝膠作為3D打印生物墨水，用于細(xì)胞球狀體的生長和釋放？

雙重交聯(lián)機制提升了材料的機械強度和穩(wěn)定性。注射型設(shè)計使其便于通過3D打印設(shè)備進行精確成型。熱響應(yīng)性質(zhì)允許材料在溫度變化下發(fā)生相變，有助于細(xì)胞球狀體的形成和釋放。材料對細(xì)胞友好，支持細(xì)胞生長和分化。適宜的物理化學(xué)環(huán)境促進細(xì)胞形成球狀體。熱響應(yīng)性簡化了細(xì)胞球狀體的回收過程
HOW—研究團隊提出一種基于海藻酸鈉接枝共聚物的雙重交聯(lián)注射型熱響應(yīng)水凝膠，作為3D打印生物墨水，用于細(xì)胞球狀體的生長和釋放。

在本研究中，作者報道了一種基于海藻酸鈉的雙交聯(lián)聚合物凝膠劑，該凝膠劑由富含疏水性共聚單體N-叔丁基丙烯酰胺[NaALG-g-P（NIPAM-co-NtBAM）]的聚（N-異丙基丙烯酰胺）的熱響應(yīng)側(cè)鏈接枝。當(dāng)加熱到臨界溫度以上時，P（NIPAM-co-NtBAM）側(cè)鏈的疏水結(jié)合誘導(dǎo)了第二次交聯(lián)，導(dǎo)致增強水凝膠（方案1）。在加熱后，海藻酸鹽側(cè)鏈的第一個離子交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)放大了雙交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)的機械性能。

方案1 該示意圖顯示了用于形成和回收細(xì)胞球狀體的可注射雙交聯(lián)海藻酸鹽基水凝膠生物墨水及其在3D生物打印中的應(yīng)用

NaALG-g-P在不同濃度Ca2+的存在下研究了水性體系陽離子。特別是，在冷熱循環(huán)之后，以1°C/min的斜坡速率，頻率為6.28 rad/s，在線性粘彈性狀態(tài)下進行振蕩剪切實驗，將應(yīng)變幅度保持在0.1%。更詳細(xì)地了解Ca2+的影響圖1顯示了基于海藻酸鹽/PNIPAM的系統(tǒng)的流變行為，所有六種配方的流變剪切振蕩數(shù)據(jù)。在圖1a的照片中可以看到三種f比不同的特征水凝膠的光學(xué)觀察。

為了探究不同交聯(lián)模式之間是否存在相互作用，過量的G′（ΔG′20–37）在20和37°C之間繪制在圖1f中，揭示了熱增稠效應(yīng)對網(wǎng)絡(luò)交聯(lián)的貢獻(xiàn)。ΔG′線性增加，二價陽離子濃度在臨界f=0.03以下和以上不同，其中由于離子鍵合而出現(xiàn)彈性。在f>0.03Δ時，G′隨f顯著升高，揭示了離子鍵合和疏水締合機制之間的協(xié)同作用。

圖1 基于海藻酸鹽/PNIPAM的系統(tǒng)的流變行為

另一個可能影響接枝共聚物雙凝膠流變行為的可調(diào)因素是熱響應(yīng)貼紙的單體組成。圖2比較了兩種海藻酸鈉/鈣凝膠劑在NtBAM含量上不同的熱響應(yīng)。疏水性NtBAM從6 mol%增強到14 mol%的主要作用是Tg的位移降低溫度約10°C。低于Tg對于兩種凝膠劑，兩個系統(tǒng)的儲存模量相等，前提是網(wǎng)絡(luò)是通過相同f的離子交聯(lián)形成的。

圖2 兩種海藻酸鈉/鈣凝膠劑在NtBAM含量上不同的熱響應(yīng)

為了便于比較，還研究了沒有附加離子交聯(lián)的體系凝膠形成。研究了無鈣體系的模量G′、G′′隨角頻率（ω）的函數(shù)，并在20°C（即低于Tg）時表現(xiàn)出類似液體的行為其中既不存在疏水相互作用，也不存在離子相互作用。在37°C時，NaALG-g-P（NIPAMx-co-NtBAMy）系統(tǒng)呈現(xiàn)較弱的凝膠狀形成，這僅僅是由于基于PNIPAM的接枝鏈的疏水性，與NaALG-g-P（NIPAM相比）x-co-NtBAMy）/Ca2+其中兩種相互作用（疏水性和離子性）共存，傳遞過大的交聯(lián)密度。

圖3 NaALG-g-P(NIPAM86-co-NtBAM14)(不含Ca2+)水凝膠呈現(xiàn)溶膠-凝膠相變

在所研究的整個溫度范圍內(nèi)，離子交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)的G′明顯更高，在TTg處形成了更具彈性的水凝膠。為了進一步評估兩種交聯(lián)之間發(fā)生的協(xié)同效應(yīng)，NaALG/Ca2+的流變行為還探索了（無接枝鏈）基水凝膠，并在與接枝共聚物相同的F和聚合物濃度下進行了比較。這些結(jié)果證明了圖3b的數(shù)據(jù)所觀察到的協(xié)同效應(yīng)的合理性。

圖4 NaALG-g-P(NIPAM86-co-NtBAM14)(不含Ca2+)水凝膠呈現(xiàn)溶膠-凝膠相變

聚合物基熱響應(yīng)水凝膠的一個重要方面是，在注射過程中剪切誘導(dǎo)的網(wǎng)絡(luò)破壞（原位凝膠化）后，它在生理溫度下恢復(fù)。因此，水凝膠/Ca2+樣品在20°C（即在注射溫度下）進行應(yīng)變掃描預(yù)處理，遠(yuǎn)高于線性粘彈性狀態(tài)（應(yīng)變振幅γ=50，其中G′′>G′），緊接著在37°C下以0.1%的應(yīng)變振幅（在線粘彈性范圍內(nèi)）進行時間掃描實驗。圖4a演示了瞬時凝膠回收率，前提是在溫度平衡至37°C后，存儲模量以損失模量為主。圖4b顯示了不同剪切速率和溫度下的后續(xù)剪切粘度步驟。
總之，作者的目標(biāo)是在37°C下形成強凝膠作為仿生基質(zhì)，以宿主細(xì)胞并促進球狀體的形成和生長。理想的生物墨水應(yīng)構(gòu)成軟凝膠，由于其輕微的粘性，可以很容易地與細(xì)胞混合，并在室溫下的打印過程中保護它們（圖5）。

圖5 5 wt% NaALG-g-P（NIPAM86-co-NtBAM14的粘度變化）含和不含Ca2+的水凝膠

作者還評估了水凝膠侵蝕，因為它是生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的重要參數(shù)，包括受控藥物釋放分析，侵蝕驅(qū)動的擴散率以及細(xì)胞封裝和釋放。如圖5c所示，單交聯(lián)水凝膠的侵蝕速度明顯快于雙交聯(lián)水凝膠。還研究了熱響應(yīng)性水凝膠的溶脹率（圖5d）。將凝膠浸入在37°C的PBS和PBS/Ca2+溶劑中。在37°C下，PBS中無鈣熱響應(yīng)材料的吸水率隨時間顯著增加，具有最高的溶脹能力（9000%）。

圖6 生物材料油墨的擴散比例

上述水凝膠再次3D打印，首先在打印機的加熱床上，在37°C下，在室溫下連續(xù)在床上，并評估生物材料油墨的擴散比例。鋪展比是通過將線寬除以針內(nèi)徑來定義的，如圖6a。通過注射策略，樣品在不同溫度下的粘性作為球狀體的潛在載貨具有重要作用。粘度較低的凝膠在注射過程中需要較小的剪切應(yīng)力來轉(zhuǎn)移細(xì)胞，并且聚合物基質(zhì)在20或37°C下的獨特侵蝕曲線可能表明在以后的細(xì)胞/球狀體3D打印過程中具有不同的細(xì)胞球狀體釋放曲線。
在本研究中，離子和熱交聯(lián)機制的相互作用顯著增強了凝膠在非常溫和的條件下的功能和機械性能（彈性模量、抗侵蝕性和溶脹控制），而不會影響所得材料的可注射性/可印刷性。

圖7 水凝膠中的細(xì)胞活力和生長

最后，為了評估作者開發(fā)的水凝膠對細(xì)胞活力和細(xì)胞形成特性的影響，作者進行了一系列3D生物打印細(xì)胞培養(yǎng)實驗。在圖7a中，來自光學(xué)顯微鏡的圖像顯示細(xì)胞在第1天均勻地分布在整個水凝膠中，而在后來的時間點上觀察到3D球體的形成。與細(xì)胞系不同，延長至15天的培養(yǎng)時間長達(dá)15天并未顯示出人類來源的單細(xì)胞形成的球狀體的進一步生長，細(xì)胞系HEK293T由于不受控制的細(xì)胞分裂（永生化細(xì)胞系）而具有相同的接種密度形成更大的球狀體，因此作者在第7天結(jié)束了對球狀體的觀察。

根據(jù)這些觀察結(jié)果，作者進行了一系列檢測，以研究3D細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞活力和增殖。發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在兩種生長培養(yǎng)基中以不同的節(jié)律增殖，通過對EdU染色表示（圖7b）。第7天樣品的EdU染色所指示的增殖能力表明，研究中使用的兩種培養(yǎng)基之間的增殖速率容量存在差異。

圖8 細(xì)胞培養(yǎng)基代謝物分析

為了進一步證明該系統(tǒng)可以支持水凝膠內(nèi)的細(xì)胞生長，對葡萄糖、乳酸和乳酸脫氫酶（LDH）等代謝物進行了額外的代謝分析。從圖8a中可以看出，葡萄糖消耗在所有鑒定的樣品中都發(fā)生了，葡萄糖消耗量在相應(yīng)對照基線的不同時間點逐漸減少。

圖9 球狀體形態(tài)學(xué)分析

最后，作者通過對DAPI染色對共聚焦顯微鏡獲得的圖像進行球狀體形態(tài)學(xué)分析，并在第3天采集phalloidin. 3D重建的圖像（圖9a），以檢查在兩種培養(yǎng)基中培養(yǎng)的水凝膠中球狀體的空間分布。通過可視化F-肌動蛋白，作者旨在研究球狀體的邊界，同時對細(xì)胞核進行染色，為作者提供了有關(guān)球狀體細(xì)胞密度的信息。作者比較了第3天與第7天球體的測量直徑，以證明球體形成動力學(xué)（圖9c）。雖然在這兩個組之間沒有發(fā)現(xiàn)每個球體中測量的細(xì)胞數(shù)量在統(tǒng)計學(xué)上存在差異（圖9e），但觀察到每個球體細(xì)胞數(shù)量的不均勻分布，這進一步驗證了這些細(xì)胞在3D培養(yǎng)環(huán)境中的特征異質(zhì)性。作者還證明，即使使用極低的起始細(xì)胞密度，hPDC細(xì)胞仍然具有形成球狀體的能力，并且存活長達(dá)7天。

結(jié)論：本文重點介紹了基于海藻酸鈉接枝共聚物的雙交聯(lián)3D打印生物墨水的發(fā)展。海藻酸鹽骨架促進了聚合物網(wǎng)絡(luò)內(nèi)原位球體的快速形成，而可逆凝膠崩解使球體易于回收，而不影響其活力和致密性。最后，發(fā)現(xiàn)溫和的雙交聯(lián)機制顯著放大了動態(tài)機械性能，從而形成了適用于3D打印功能性活細(xì)胞群的穩(wěn)健聚合物網(wǎng)絡(luò)。作者提出的方法允許在溫和條件下開發(fā)具有自愈和剪切稀化特性的聚合物網(wǎng)絡(luò)，以便可以承載和促進細(xì)胞球狀體形成，從而能夠在各種生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中利用這些生物材料作為細(xì)胞球狀體封裝劑用于藥物篩選、微組織形成、3D體外建模和可注射治療。

原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2023.120790