3D打印生物活性纖維增強(qiáng)水凝膠助力肌腱再生

來(lái)源： EFL生物3D打印與生物制造

肌腱連接處（MTJ）是位于肌肉和肌腱交界處的一種復(fù)雜而特殊的組織，負(fù)責(zé)將力量從收縮的骨骼肌通過(guò)肌腱傳遞到骨骼。作為肌肉和肌腱的交界處，MTJ 在日常運(yùn)動(dòng)或鍛煉中的重復(fù)負(fù)荷下承受著集中的機(jī)械應(yīng)力，因此，MTJ 的損傷非常普遍。據(jù)報(bào)道，28% 的肌肉-肌腱-骨骼復(fù)合體損傷發(fā)生在 MTJ，其風(fēng)險(xiǎn)在肌肉、肌腱、肌肉-肌腱界面和肌腱-骨骼界面損傷中位居第二。目前臨床上治療 MTJ 損傷的方法包括非甾體抗炎藥和物理療法等保守療法，以及使用各種縫合技術(shù)進(jìn)行手術(shù)干預(yù)。然而，其有效性受到以下幾個(gè)方面的限制：(i)瘢痕組織的形成導(dǎo)致機(jī)械強(qiáng)度不足，導(dǎo)致治療后復(fù)發(fā)率較高；(ii)MTJ 損傷處或附近的縫合切口，經(jīng)常導(dǎo)致 MTJ 重建失��；(iii)大面積 MTJ 缺損的修復(fù)具有挑戰(zhàn)性，尤其是在肌肉和肌腱損傷后回縮的情況下。因此，目前的干預(yù)措施無(wú)法同時(shí)促進(jìn) MTJ 的結(jié)構(gòu)和功能修復(fù)，因此有必要開發(fā)前景廣闊的高質(zhì)量 MTJ 再生策略。

來(lái)自南京醫(yī)科大學(xué)的姚慶強(qiáng)團(tuán)隊(duì)與來(lái)自東南大學(xué)的張薇等團(tuán)隊(duì)合作開發(fā)了一種含有間充質(zhì)干細(xì)胞和 Klotho 的3D打印生物活性纖維增強(qiáng)水凝膠，用于 MTJ 的結(jié)構(gòu)和功能再生。在大鼠MTJ缺損模型中，生物活性纖維增強(qiáng)水凝膠促進(jìn)了肌肉、肌腱和肌肉-肌腱界面的結(jié)構(gòu)恢復(fù)，并增強(qiáng)了損傷MTJ的功能恢復(fù)。體內(nèi)蛋白質(zhì)組學(xué)和體外細(xì)胞培養(yǎng)闡明了生物活性纖維增強(qiáng)水凝膠通過(guò)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的再生機(jī)制，從而設(shè)計(jì)出一種優(yōu)化的微環(huán)境來(lái)支持移植間充質(zhì)干細(xì)胞的存活和分化，并維持 MTJ 組織內(nèi)常駐細(xì)胞（包括肌腱/肌肉細(xì)胞和巨噬細(xì)胞）的功能表型。這種策略為治療 MTJ 損傷提供了一種前景廣闊的方法。相關(guān)工作以題為“Bioactive fiber-reinforced hydrogel to tailor cell microenvironment for structural and functional regeneration of myotendinous junction”的文章發(fā)表在2024年04月24日的國(guó)際頂級(jí)期刊《Science Advances》。

1. 創(chuàng)新型研究?jī)?nèi)容
本研究開發(fā)了一種3D打印纖維增強(qiáng)多功能水凝膠，為MTJ的結(jié)構(gòu)和功能再生提供足夠的機(jī)械支持和定制合適的微環(huán)境（圖1A）。在這種生物活性纖維增強(qiáng)水凝膠系統(tǒng)中，3D打印聚（乳酸-共聚-乙醇）酸（PLGA）支架具有良好的排列結(jié)構(gòu)，可為MTJ的生理功能提供足夠的機(jī)械強(qiáng)度；間充質(zhì)干細(xì)胞的引入可增強(qiáng)肌肉和肌腱的促再生生物活性，Klotho的負(fù)載可改善MTJ損傷后外源性間充質(zhì)干細(xì)胞和內(nèi)源性MTJ駐留細(xì)胞的病理環(huán)境；此外，將光交聯(lián)甲基丙烯酰絲纖維素（SilMA）水凝膠融合到 PLGA 支架中，作為輸送 Klotho 的載體，并為間充質(zhì)干細(xì)胞的保留和存活提供3D富水微環(huán)境。本研究首先評(píng)估了生物活性纖維增強(qiáng)水凝膠的理化性質(zhì)和細(xì)胞相容性。隨后，將水凝膠系統(tǒng)植入大鼠 MTJ 缺陷模型，以評(píng)估其在促進(jìn) MTJ 結(jié)構(gòu)和功能再生方面的原位功效。進(jìn)行了體內(nèi)蛋白質(zhì)組學(xué)分析，以揭示水凝膠系統(tǒng)促進(jìn) MTJ 再生的內(nèi)在機(jī)制。根據(jù)蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果，進(jìn)行了進(jìn)一步研究，探討通過(guò)水凝膠系統(tǒng)操縱細(xì)胞微環(huán)境是否以及如何調(diào)節(jié)移植間充質(zhì)干細(xì)胞和常駐細(xì)胞的行為，從而促進(jìn) MTJ 再生。

【制備生物活性纖維增強(qiáng)水凝膠并對(duì)其進(jìn)行表征】
為MTJ再生設(shè)計(jì)一種具有足夠機(jī)械強(qiáng)度和再生生物活性的理想組織工程支架，本研究開發(fā)了一種負(fù)載間充質(zhì)干細(xì)胞和 Klotho 的 PLGA 纖維增強(qiáng) SilMA 水凝膠（圖 1A）。利用熔融沉積建模（FDM）3D打印技術(shù)，制作了具有正交排列網(wǎng)格和相互連接的大孔的 PLGA 支架，為受傷的 MTJ 的力傳導(dǎo)和組織生長(zhǎng)提供機(jī)械和結(jié)構(gòu)支持。隨后，將 SilMA 前體、間充質(zhì)干細(xì)胞和重組 Klotho 的混合物融合到 PLGA 支架中，并通過(guò)光交聯(lián)形成具有微孔和互連結(jié)構(gòu)的纖維增強(qiáng)水凝膠。作為間充質(zhì)干細(xì)胞和生物活性分子的多功能載體，SilMA 水凝膠的引入提高了間充質(zhì)干細(xì)胞的保留率，為細(xì)胞生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)交換建立了有利的3D微環(huán)境，并有效地充當(dāng)了 Klotho 的釋放系統(tǒng)。掃描電子顯微鏡（SEM）圖像顯示，微孔 SilMA 水凝膠滲入大孔 PLGA 支架的間隙中，從而提供了有利于細(xì)胞粘附的更佳微環(huán)境（圖 1B）。PLGA（PA）、SilMA-PLGA（SM-PA）和 Klotho@SilMA-PLGA （K@SM-PA）支架的 PLGA 纖維直徑約為 340 μm（圖 1C）。此外，SM-PA 和 K@SM-PA 支架的孔面積沒有明顯差異，表明 Klotho 的加入對(duì) SilMA 水凝膠的微孔結(jié)構(gòu)沒有顯著影響（圖 1D）。對(duì)播種了間充質(zhì)干細(xì)胞的纖維增強(qiáng)水凝膠進(jìn)行的掃描電鏡分析表明，間充質(zhì)干細(xì)胞以球形或紡錘形形態(tài)包埋在 SilMA 水凝膠基質(zhì)中。

圖1 生物活性纖維增強(qiáng)水凝膠的制造與表征

【生物活性纖維增強(qiáng)水凝膠能有效促進(jìn)大鼠 MTJ 的結(jié)構(gòu)和功能再生】

利用大鼠 MTJ 缺損模型評(píng)估了本研究的生物活性纖維增強(qiáng)水凝膠對(duì) MTJ 再生的功效（圖 2A）。未經(jīng)處理的 MTJ 缺損設(shè)為對(duì)照組。植入 4 周后，對(duì) MTJ 缺損處的再生組織進(jìn)行組織學(xué)檢查。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，術(shù)后 4 周時(shí)，殘留支架占據(jù)了再生組織的一定空間，阻礙了典型 MTJ 結(jié)構(gòu)的清晰呈現(xiàn)。因此，位于缺損處和鄰近支架的修復(fù)組織被用來(lái)評(píng)估 MTJ 修復(fù)情況。血紅素和伊紅（H&E）以及馬森三色染色顯示，M@SM-PA 組和 K/M@SM-PA 組再生的 MTJ 組織顯示出肌肉和肌腱纖維的廣泛插入，并有明顯的相互交錯(cuò)，而 Ctrl 組和 SM-PA 組的組織則顯示出罕見、不規(guī)則和短的相互交錯(cuò)（圖 2B 和 C）。還觀察到 M@SM-PA 和 K/M@SM-PA 水凝膠比 Ctrl 和 SM-PA 支架能誘導(dǎo)形成更有組織的肌腱纖維，K/M@SM-PA 組的肌腱膠原纖維呈原生波浪狀（圖2B 和 C）。定量分析顯示，與其他三組相比，K/M@SM-PA 組的肌腱組織學(xué)評(píng)分明顯較低，表明其形成的組織更像肌腱（圖 2G）。在再生肌肉組織方面，K/M@SM-PA 組與 Ctrl、SM-PA 和 M@SM-PA 組相比，肌纖維直徑明顯增加，表明 K/M@SM-PA 水凝膠促進(jìn)了肌肉再生（圖 2B、C 和 H）。總之，這些發(fā)現(xiàn)意味著生物活性纖維增強(qiáng)水凝膠在促進(jìn) MTJ 組織形成和重塑方面具有很高的功效。

圖2 生物活性纖維增強(qiáng)水凝膠可促進(jìn)大鼠 MTJ 的結(jié)構(gòu)再生

本研究通過(guò)步態(tài)分析和機(jī)械測(cè)試進(jìn)一步評(píng)估了修復(fù)后 MTJ 的功能恢復(fù)情況。步態(tài)分析是通過(guò)評(píng)估行為表型來(lái)評(píng)估 MTJ 功能的一種可行且無(wú)創(chuàng)的方法。如圖 3A 至 C所示，使用實(shí)時(shí)熒光成像系統(tǒng)捕捉大鼠行走時(shí)的爪印。在指定時(shí)間點(diǎn)（術(shù)后 1 周、2 周和 4 周）收集大鼠爪印并對(duì)步態(tài)參數(shù)進(jìn)行綜合分析，包括時(shí)空參數(shù)（步長(zhǎng)、擺動(dòng)時(shí)間和擺動(dòng)速度）和強(qiáng)度參數(shù)（平均強(qiáng)度、最大接觸平均強(qiáng)度和最大接觸最大強(qiáng)度）（圖 3D 和 E）。隨著疼痛程度的增加，大鼠的行走運(yùn)動(dòng)受到不利影響，導(dǎo)致除擺動(dòng)時(shí)間外的所有上述參數(shù)下降。結(jié)果顯示，與正常大鼠相比，術(shù)后 1 周所有組大鼠的步態(tài)均出現(xiàn)異常，步長(zhǎng)和步幅明顯減少（圖 3F 和 I 至 K）。從第 1 周到第 4 周，這些參數(shù)逐漸接近甚至超過(guò)正常大鼠，其中 K/M@SM-PA 組的恢復(fù)最為明顯（圖 3F 至 K）。具體來(lái)說(shuō)，術(shù)后第 2 周，K/M@SM-PA 組的步長(zhǎng)和擺動(dòng)速度值明顯高于 Ctrl 組（P < 0.05）（圖 3F 和 H）。此外，K/M@SM-PA 組大鼠的擺動(dòng)速度值在術(shù)后 2 周已超過(guò)正常大鼠（圖 3H）。在擺動(dòng)時(shí)間方面，K/M@SM-PA組大鼠在術(shù)后1周和2周的擺動(dòng)時(shí)間值最低，表明K/M@SM-PA水凝膠治療后大鼠的行走運(yùn)動(dòng)得到了改善，但組間差異不顯著（圖3G）。此外，K/M@SM-PA 組的強(qiáng)度參數(shù)在所有組別中表現(xiàn)出最高水平，包括術(shù)后 4 周的平均強(qiáng)度、最大接觸平均強(qiáng)度和最大接觸最大強(qiáng)度（圖 3I 至 K）。這表明，K/M@SM-PA 治療后，大鼠的站立姿勢(shì)更加穩(wěn)定，疼痛減輕�？傊�，上述步態(tài)分析表明，在植入生物活性纖維增強(qiáng)水凝膠后，MTJ 的功能恢復(fù)得到了顯著改善。

圖3 生物活性纖維增強(qiáng)水凝膠促進(jìn)大鼠 MTJ 的功能恢復(fù)

【體內(nèi)蛋白質(zhì)組學(xué)揭示生物活性纖維增強(qiáng)水凝膠促進(jìn) MTJ 再生的內(nèi)在機(jī)制】

為闡明K/M@SM-PA促進(jìn)MTJ再生的機(jī)制，對(duì)術(shù)后2周的再生MTJ組織進(jìn)行了體內(nèi)無(wú)標(biāo)記蛋白質(zhì)組學(xué)分析。對(duì)來(lái)自 M@SM-PA 組和 K/M@SM-PA 組的三個(gè)獨(dú)立重復(fù)序列進(jìn)行了測(cè)序，聚類分析后的差異表達(dá)蛋白（DEPs）熱圖顯示，這兩組之間的蛋白表達(dá)量存在顯著差異（圖 4A）。主成分分析（PCA）顯示，每組的三個(gè)重復(fù)品都有明顯的聚類（圖 4B）。如火山圖所示，共鑒定出 937 個(gè)蛋白質(zhì)，其中有 193 個(gè)上調(diào)的 DEPs 和 553 個(gè)下調(diào)的 DEPs（K/M@SM-PA 與 M@SM-PA）（圖 4C）。為深入了解這些DEPs的功能，研究人員進(jìn)行了基因本體（GO）富集分析，以揭示發(fā)生變化的生物過(guò)程（BPs）、細(xì)胞成分（CCs）和分子功能（MF）。如圖 4D 所示如圖 4D 所示，上調(diào)的 DEPs（K/M@SM-PA 與 M@SM-PA）富集了幾個(gè)與 MTJ 再生高度相關(guān)的 GO 術(shù)語(yǔ)，包括 BP 中的 “肌肉系統(tǒng)過(guò)程”、“橫紋肌收縮”、“骨骼肌收縮”、“肌肉結(jié)構(gòu)發(fā)育”和“骨骼肌組織發(fā)育”；CC 中的“肌球蛋白復(fù)合物”、“錨定連接”、“局灶粘附”和 “肌肉-肌腱連接”；以及 MF 中的“肌肉α-肌動(dòng)蛋白結(jié)合”。這些術(shù)語(yǔ)大多與骨骼肌的發(fā)育和功能維持有關(guān)，表明在纖維增強(qiáng)水凝膠系統(tǒng)中加入Klotho能有效促進(jìn)MTJ缺損中骨骼肌的再生，這與組織學(xué)結(jié)果一致（圖2B、C、F、H和K）。對(duì)上調(diào)的 DEPs 進(jìn)行的 BinGO 分析也顯示了一致的結(jié)果。還發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)與肌肉-肌腱界面相關(guān)的 CC 術(shù)語(yǔ)，包括“錨連接”、“局灶粘附”和“肌腱連接”（圖 4D），這可能與 MTJ 標(biāo)記表達(dá)上調(diào)和肌肉-肌腱整合改善有關(guān)（圖 2，D 和 I）。在這些術(shù)語(yǔ)中，“局灶粘附”和“錨連接”是 MTJ 的關(guān)鍵組成部分。它們與肌球蛋白的肌動(dòng)蛋白絲相連，肌動(dòng)蛋白絲附著在細(xì)胞外的層粘連蛋白上，促進(jìn)了肌纖維與肌腱 ECM 的錨定。然而，可能由于缺乏足夠的肌腱特征標(biāo)記物，沒有肌腱特異性術(shù)語(yǔ)被富集。為克服 DEP 富集分析的局限性，還對(duì)所有鑒定出的蛋白質(zhì)進(jìn)行了基因組富集分析（GSEA）。結(jié)果顯示，在比較 K/M@SM-PA 和 M@SM-PA 時(shí)，多個(gè)與肌肉相關(guān)的 BP、CC 和 MF 術(shù)語(yǔ)發(fā)生了顯著變化（圖 4E），證實(shí)了 Klotho 在促進(jìn)肌肉再生方面的顯著作用，這與之前的報(bào)道一致。

圖4 體內(nèi)全局蛋白質(zhì)組學(xué)揭示了生物活性纖維增強(qiáng)水凝膠促進(jìn) MTJ 再生的內(nèi)在機(jī)制

【生物活性纖維增強(qiáng)型水凝膠可促進(jìn)細(xì)胞存活并支持移植間充質(zhì)干細(xì)胞的成腱/成肌分化】

為證實(shí) Klotho- 加入生物活性纖維增強(qiáng)水凝膠對(duì)間葉干細(xì)胞存活的保護(hù)作用，在體外應(yīng)用 H2O2 和 IL-1β 刺激誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激，模擬損傷 MTJ 的病理環(huán)境。采用 2′，7′-二氯熒光素-二乙酸酯（DCFH-DA）測(cè)定和定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）來(lái)評(píng)估水凝膠系統(tǒng)的抗氧化活性。間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)H2O2或IL-1β處理后，H2O2-或IL-1β處理組的ROS陽(yáng)性細(xì)胞較Ctrl組（未經(jīng)H2O2或IL-1β處理）顯著增加，證實(shí)H2O2和IL-1β處理能有效促進(jìn)ROS生成并誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞氧化應(yīng)激（圖5A和B）。代表性圖像和定量分析顯示，H2O2/IL-1β + K@SM-PA 水凝膠處理的間充質(zhì)干細(xì)胞在 H2O2- 和 IL-1β 誘導(dǎo)的 ROS 模型中的 ROS 陽(yáng)性細(xì)胞率分別為 11.71 ± 0.77% 和 23.02 ± 7.63%，明顯低于 H2O2/IL-1β 處理的間充質(zhì)干細(xì)胞（H2O2-94.15±1.56%，P＜0.0001；IL-1β為96.67±0.68%，P＜0.0001）和H2O2/IL-1β+SM-PA水凝膠（H2O2為86.05±5.86%，P＜0.0001；IL-1β為96.91±1.93%，P＜0.0001）（圖5A和B）。

qPCR結(jié)果顯示，H2O2刺激后，超氧化物歧化酶-1（SOD-1）、錳依賴性超氧化物歧化酶（MnSOD，又稱SOD-2）和過(guò)氧化氫酶（CAT）的表達(dá)水平在H2O2組和H2O2+SM-PA組明顯升高（圖5C至E），表明間充質(zhì)干細(xì)胞受到的氧化應(yīng)激增加，激活了其內(nèi)在的抗氧化防御系統(tǒng)。這與之前的一項(xiàng)研究一致，該研究用各種促氧化劑（包括 H2O2、百草枯和甲萘醌）處理 C2C12 肌肉細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn) C2C12 細(xì)胞會(huì)激活抗氧化防御系統(tǒng)以應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激，表現(xiàn)出幾種抗氧化酶的表達(dá)顯著增加，包括 MnSOD、CAT、Cu/Zn-超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶。相比之下，與 H2O2 組和 H2O2 + SM-PA 組相比，H2O2 + K@SM-PA 組的間充質(zhì)干細(xì)胞在 Klotho 處理后受到的氧化應(yīng)激水平較低（圖 5C 至 E），SOD-1、SOD-2 和 CAT 的表達(dá)明顯降低就是證明。這些結(jié)果表明，負(fù)載有 Klotho 的纖維增強(qiáng)水凝膠具有顯著的抗氧化生物活性，能有效清除病理微環(huán)境中的 ROS。

圖5 生物活性纖維增強(qiáng)水凝膠通過(guò)抑制氧化應(yīng)激提高細(xì)胞存活率并支持間充質(zhì)干細(xì)胞分化

【生物活性纖維增強(qiáng)水凝膠通過(guò)抑制氧化應(yīng)激維持肌母細(xì)胞和肌腱干細(xì)胞的表型】

本研究的體內(nèi)蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)顯示，K/M@SM-PA水凝膠可以抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，從而維持內(nèi)源性和外源性細(xì)胞的表型和功能，啟動(dòng)MTJ的再生過(guò)程（圖4）。除了移植的間充質(zhì)干細(xì)胞外，MTJ 內(nèi)的常駐細(xì)胞群也能對(duì)生物活性纖維增強(qiáng)水凝膠改善的微環(huán)境做出反應(yīng)，從而啟動(dòng) MTJ 再生的細(xì)胞過(guò)程。鑒于生物活性纖維增強(qiáng)水凝膠對(duì)移植間充質(zhì)干細(xì)胞的抗氧化作用已得到證實(shí)，本研究將評(píng)估范圍擴(kuò)大到分別代表肌肉和肌腱組織內(nèi)細(xì)胞的 C2C12 細(xì)胞和肌腱干/祖細(xì)胞（TSPCs）（圖 6A）。同樣，C2C12和TSPCs受到H2O2和IL-1β的刺激，并進(jìn)行DCFH-DA檢測(cè)以評(píng)估細(xì)胞內(nèi)的ROS。當(dāng)用 H2O2/IL-1β 和 H2O2/IL-1β + SM-PA 處理時(shí)，C2C12 和 TSPCs 表現(xiàn)出的 ROS 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯高于對(duì)照組，證實(shí)了這兩種細(xì)胞中氧化應(yīng)激的成功誘導(dǎo)（圖 6B 至 E）。研究發(fā)現(xiàn)，與 H2O2 + SM-PA 組相比，H2O2 + K@SM-PA 組的兩類細(xì)胞的 ROS 生成量都大大降低（圖 6B 和 C）。C2C12（1.77 ± 1.26% 對(duì) 17.44 ± 2.78%，P < 0.05）和 TSPCs（4.66 ± 2.11% 對(duì) 55.27 ± 9.93%，P < 0.0001）中的 ROS 陽(yáng)性細(xì)胞率均有所下降（圖 6F 和 G）。此外，在IL-1β刺激模型中，在C2C12和TSPCs中也觀察到了類似但更顯著的效果，與SM-PA水凝膠相比，K@SM-PA水凝膠中C2C12（1.42±0.61%對(duì)22.33±3.76%，P＜0.001）和TSPCs（3.80±2.01%對(duì)67.28±7.53%，P＜0.0001）的ROS陽(yáng)性細(xì)胞率顯著降低（圖6D、E、H和I）。這些結(jié)果共同證實(shí)了所開發(fā)的纖維增強(qiáng)水凝膠對(duì)肌肉和肌腱系細(xì)胞具有很強(qiáng)的抗氧化能力。

圖6 生物活性纖維增強(qiáng)水凝膠通過(guò)抑制氧化應(yīng)激維持 C2C12 和 TSPC 的功能表型

【生物活性纖維增強(qiáng)水凝膠引導(dǎo)巨噬細(xì)胞從促炎表型極化為抗炎表型】

本研究采用了常用的 M1 型巨噬細(xì)胞極化誘導(dǎo)劑脂多糖（LPS）（圖 7A）。IF 染色顯示，與 Ctrl 組相比，LPS 刺激可顯著上調(diào)巨噬細(xì)胞中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）（M1 標(biāo)志物）的表達(dá)水平（P < 0.01），而 CD206 和精氨酸酶-1（ARG-1）（M2 標(biāo)志物）的表達(dá)則明顯下降，證實(shí)了 LPS 誘導(dǎo)后巨噬細(xì)胞的 M1 極化（圖 7B 至 E）。與 LPS 組（P < 0.05）和 SM-PA 組（P < 0.05）相比，K@SM-PA 組的 iNOS 蛋白表達(dá)水平大幅下降（圖 7B 和 E）。相反，與 LPS 組和 SM-PA 組相比，K@SM-PA 組 M2 標(biāo)志物（CD206 和 ARG-1）的蛋白表達(dá)明顯升高，如圖 7（C 至 E）所示。與此相一致，本研究發(fā)現(xiàn) K@SM-PA 水凝膠可部分減輕 LPS 刺激后 CCR-7 表達(dá)的增加，而 SM-PA 水凝膠則不能（圖 7F）。同時(shí)，與 LPS 組（P < 0.05）和 SM-PA 組（P < 0.05）相比，K@SM-PA 水凝膠誘導(dǎo)的 CD206 表達(dá)量明顯增加（圖 7F）。IL-10的表達(dá)也有類似的趨勢(shì)，但沒有顯著差異（圖7F）。總之，這些結(jié)果表明，Klotho負(fù)載的纖維增強(qiáng)水凝膠通過(guò)引導(dǎo)巨噬細(xì)胞從M1表型極化到M2表型發(fā)揮了抗炎作用。

圖7 生物活性纖維增強(qiáng)型水凝膠引導(dǎo)巨噬細(xì)胞從 M1 表型極化到 M2 表型

本研究開發(fā)了一種纖維增強(qiáng)水凝膠，它能為力傳導(dǎo)提供足夠的機(jī)械支持，同時(shí)具有免疫調(diào)節(jié)和抗氧化生物活性，以改善具有挑戰(zhàn)性的損傷后微環(huán)境，最終調(diào)節(jié)外源性和內(nèi)源性細(xì)胞的行為，促進(jìn)體內(nèi) MTJ 的結(jié)構(gòu)和功能再生（圖 8）。3D打印的 PLGA 支架的排列結(jié)構(gòu)使水凝膠系統(tǒng)具有接近于原生 MTJ 的強(qiáng)大機(jī)械性能，可有效支持肌肉-肌腱界面的力傳遞，從而維持 MTJ 再生過(guò)程中的生理功能。在水凝膠系統(tǒng)中加入 Klotho 可減輕氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，從而創(chuàng)造一個(gè)有利于再生的微環(huán)境，保護(hù) MTJ 損傷中各種細(xì)胞群的功能和表型。它能提高移植間充質(zhì)干細(xì)胞的存活率，并支持其多向分化能力，可能有助于在隨后的肌肉和肌腱再生過(guò)程中增強(qiáng)肌源性/腱源性分化。此外，改善的微環(huán)境還能維持 MTJ 中常駐肌腱/肌肉細(xì)胞的功能表型，并調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞向抗炎表型的極化。

圖8 促進(jìn) MTJ 再生的生物活性纖維增強(qiáng)水凝膠示意圖

2. 總結(jié)與展望
本研究開發(fā)了一種生物活性纖維增強(qiáng)水凝膠，它具有足夠的機(jī)械強(qiáng)度、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)生物活性、干細(xì)胞遞送特性和內(nèi)源性細(xì)胞調(diào)節(jié)功能，可同時(shí)促進(jìn)MTJ的結(jié)構(gòu)和功能再生。在這種水凝膠系統(tǒng)中，帶有排列整齊纖維的3D打印聚乳酸（PLGA）支架賦予了水凝膠足夠的機(jī)械強(qiáng)度，以維持 MTJ 的生理功能。由于 Klotho 的加入抑制了氧化應(yīng)激，該支架為移植間充質(zhì)干細(xì)胞的存活和分化提供了有利的微環(huán)境，同時(shí)保持了 TSPCs 和肌母細(xì)胞的功能表型特征，從而啟動(dòng)了 MTJ 的再生過(guò)程。此外，它還具有免疫調(diào)節(jié)功能，能使巨噬細(xì)胞從促炎的 M1 表型恢復(fù)到抗炎的 M2 表型。與以往主要在體外進(jìn)行的 MTJ 組織工程研究不同，本研究定制了一個(gè)優(yōu)化的細(xì)胞微環(huán)境，以調(diào)節(jié)體內(nèi)不同的細(xì)胞群，從而增強(qiáng) MTJ 的結(jié)構(gòu)修復(fù)和功能恢復(fù)。本研究獲得的啟示為未來(lái)治療 MTJ 損傷帶來(lái)了巨大希望。

文章來(lái)源：
https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adm7164