上海大學(xué)蘇佳燦：3D打印GelMA/ AlgMA/羥基磷灰石支架用于構(gòu)建功能性骨類器官

來源： EFL生物3D打印與生物制造

應(yīng)對大骨缺損仍然是一個(gè)重大挑戰(zhàn)，因?yàn)樽杂�能力的固有限制�?dǎo)致了長時(shí)間的康復(fù)和亞優(yōu)化再生。雖然目前有臨床解決方案可用，但它們存在明顯的缺點(diǎn)，需要更有效的骨再生方法。源自干細(xì)胞的器官樣結(jié)構(gòu)在這個(gè)領(lǐng)域顯示出巨大潛力；然而，骨器官樣結(jié)構(gòu)的發(fā)展受到特定需求的限制，包括需要由支架和混合細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）提供堅(jiān)固的機(jī)械支持。在這種背景下，生物打印技術(shù)已經(jīng)成為復(fù)制骨組織復(fù)雜結(jié)構(gòu)的強(qiáng)大手段。

來自上海大學(xué)的蘇佳燦等團(tuán)隊(duì)與來自上海第六人民醫(yī)院的施忠民團(tuán)隊(duì)合作開發(fā)了一種利用新型生物墨水（GelMA/AlgMA/羥基磷灰石）制造高度復(fù)雜的骨細(xì)胞外基質(zhì)模擬物的方法。生物打印支架有助于長期培養(yǎng)和逐漸成熟的大規(guī)模生物打印骨器官樣結(jié)構(gòu)，促進(jìn)多細(xì)胞分化，并為骨形成的初始階段提供有價(jià)值的見解。本研究的生物墨水的內(nèi)在自礦化特性與天然骨的性質(zhì)非常接近，為器官樣結(jié)構(gòu)賦予了增強(qiáng)的骨修復(fù)能力，適用于體外和體內(nèi)應(yīng)用。這項(xiàng)開創(chuàng)性的研究推動了骨組織工程領(lǐng)域的發(fā)展，并在將其轉(zhuǎn)化為實(shí)際應(yīng)用方面具有重大的潛力。相關(guān)工作以題為“Engineering Large-Scale Self-Mineralizing Bone Organoids with Bone Matrix-Inspired Hydroxyapatite Hybrid Bioinks”的文章發(fā)表在2024年04月20日的國際頂級期刊《Advanced Materials》。

1. 創(chuàng)新型研究內(nèi)容
本研究開發(fā)了一種生物墨水配方來模擬骨的復(fù)雜細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的方法，該配方將羥基磷灰石與Gelatin Methacrylate和Alginate Methacrylate（GelMA/AlgMA）等有機(jī)聚合物結(jié)合在一起。所得的生物墨水具有獨(dú)特的自我礦化和細(xì)胞分化能力。當(dāng)用于生物打印骨器官樣結(jié)構(gòu)支架時(shí)，這些構(gòu)建物在體外和體內(nèi)都顯示出功能性的機(jī)械支持、長期細(xì)胞培養(yǎng)和自我礦化能力。值得注意的是，在體內(nèi)培養(yǎng)時(shí)，生物打印的器官樣結(jié)構(gòu)演變?yōu)轭愃扑笮喂堑慕Y(jié)構(gòu)，表明骨器官樣結(jié)構(gòu)的高度成熟性和其與天然海綿骨的機(jī)械相似性。值得注意的是，GelMA和GelMA/AlgMA等有機(jī)生物墨水無法形成骨器官樣結(jié)構(gòu)。這項(xiàng)開創(chuàng)性的研究標(biāo)志著首次成功制備了用于生物打印骨器官樣結(jié)構(gòu)支架的混合生物墨水，并強(qiáng)調(diào)了無機(jī)成分在骨器官樣結(jié)構(gòu)發(fā)展中的重要性，為進(jìn)一步研究骨發(fā)育初期的分化和基質(zhì)形成鋪平了道路。受合成骨基質(zhì)啟發(fā)的具有自我礦化性能的生物墨水使得工程化的骨器官樣結(jié)構(gòu)能夠密切模擬天然骨組織的結(jié)構(gòu)、功能和再生潛力。這一進(jìn)展的影響擴(kuò)展到骨組織工程的各種應(yīng)用，包括疾病建模、藥物篩選、個(gè)性化醫(yī)學(xué)和再生醫(yī)學(xué)。

【生物墨水和印刷支架的表征】
這些生物墨水表現(xiàn)出良好的可打印性，能夠產(chǎn)生精細(xì)的模型，包括兔子模型，具有高精度的打印，即使在幾毫米大小的尺寸上也能保持如此。為評估多孔打印能力，本研究打印了多孔支架。從頂視圖的分析中可以看出，即使在孔徑為50微米的情況下，所有孔隙都能夠一致地打印出來。本研究選擇了一個(gè)具有優(yōu)勢多孔結(jié)構(gòu)的代表性圓柱支架用于后續(xù)的生物實(shí)驗(yàn)，因?yàn)檫@種結(jié)構(gòu)有利于營養(yǎng)物質(zhì)的傳遞和細(xì)胞生長（圖1A）。掃描電子顯微鏡圖像證實(shí)，打印的支架具有精確的多孔結(jié)構(gòu)，適合于胞載體應(yīng)用。此外，GelMA/AlgMA/HAP打印的支架表面發(fā)現(xiàn)了Ca/P元素（圖1C），而GelMA和GelMA/AlgMA支架沒有出現(xiàn)Ca/P元素。為減輕凍干后水凝膠的形態(tài)改變，本研究進(jìn)行了冷凍掃描電子顯微鏡觀察。GelMA/AlgMA/HAP水凝膠展示了更均勻的微孔結(jié)構(gòu)。這對于成骨細(xì)胞礦化和構(gòu)建納米到微米級別的骨梁是有利的（圖1B）。通過分析應(yīng)力-應(yīng)變曲線在彈性區(qū)域的斜率，特別是初始線性部分，確定了水凝膠的抗壓模量。值得注意的是，使用GelMA/AlgMA/HAP生物墨水的組具有比單獨(dú)使用GelMA的組更大的斷裂應(yīng)變（圖1D）。復(fù)合水凝膠的抗壓強(qiáng)度和抗壓模量依次為50 kPa / 0.09 MPa，57 kPa / 0.12 MPa，和170 kPa / 0.40 MPa，分別對應(yīng)GelMA，GelMA/AlgMA和GelMA/AlgMA/HAP（圖1E-F）。與GelMA水凝膠相比，引入AlgMA導(dǎo)致了抗壓強(qiáng)度和模量的增加，但差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒有顯著。此外，GelMA/AlgMA/HAP的抗壓模量顯著增加了約400%（圖1F）。

圖1 對合成的GelMA、GelMA/AlgMA和GelMA/AlgMA/HAP生物墨水以及它們相應(yīng)的支架進(jìn)行分析和評估

【3D生物打印支架可在體外維持長期細(xì)胞培養(yǎng)】

確保細(xì)胞的良好存活、附著和增殖對于工程組織支架非常重要，特別是對于封裝細(xì)胞的支架（圖2）。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）被封裝在生物墨水中，并打印成支架形狀（圖2A）。活/死細(xì)胞檢測結(jié)果有力地證明，在整個(gè)14天的培養(yǎng)期間，所有組的細(xì)胞存活良好，驗(yàn)證了生物墨水能夠維持BMSCs的長期存活能力（圖2C-D）。在初次打印時(shí)，細(xì)胞均勻分布在生物墨水中，呈現(xiàn)為離散的點(diǎn)狀。然而，隨著時(shí)間的推移，觀察到一個(gè)值得注意的現(xiàn)象。BMSCs向支架表面遷移，逐漸增殖并擴(kuò)展其存在，最終形成復(fù)雜的三維細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)。這些細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)在培養(yǎng)7天后變得越來越明顯，伴有擴(kuò)展的細(xì)胞細(xì)胞骨架。這些有力的觀察共同強(qiáng)調(diào)，在體外逐漸降解的同時(shí)，生物打印的支架保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，能夠支持BMSCs的培養(yǎng)。CCK-8試驗(yàn)的結(jié)果也證實(shí)了這些發(fā)現(xiàn)（圖2B）。總體而言，本研究凸顯了三維生物打印的胞載體支架在長期培養(yǎng)過程中有效地促進(jìn)細(xì)胞的存活和生長，為骨器官樣結(jié)構(gòu)的形成奠定了基礎(chǔ)。

圖2 生物打印的負(fù)載骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）的GelMA、GelMA/AlgMA和GelMA/AlgMA/HAP支架的生物相容性評估

【體外 3D 生物打印支架增強(qiáng)成骨分化】

在成功展示了生物打印支架的長期細(xì)胞培養(yǎng)潛力后，本研究進(jìn)行了一個(gè)關(guān)鍵的驗(yàn)證步驟，評估其作為干細(xì)胞載體形成復(fù)雜骨器官樣結(jié)構(gòu)的能力。為進(jìn)一步評估不同組的成骨潛能，本研究在體外培養(yǎng)40天后對支架進(jìn)行了堿性磷酸酶（ALP）和茜素紅（ARS）染色。ALP染色顯示GelMA/AlgMA/HAP組的ALP表達(dá)最高。ARS染色用于研究不同支架中BMSCs的礦化水平。ARS與鈣形成橙紅色螯合物，作為骨成骨礦化的指示物。GelMA和GelMA/AlgMA在茜素紅染色中顯示出最低的鈣或磷含量。相反，GelMA/AlgMA/HAP顯示出明顯的鈣和磷沉積，以及更多的鈣化結(jié)節(jié)（圖3A）。在體外培養(yǎng)14天后，我們通過測量ALP和ARS活性定量評估了BMSCs分化成成骨細(xì)胞的情況。GelMA/AlgMA/HAP組的ALP和ARS活性分別為2.01 ± 0.14和1.74 ± 0.11，比GelMA組分別高出近6倍和9倍（圖3B-C）。本研究對支架進(jìn)行了溶解，并通過RT-PCR進(jìn)一步評估所獲得的細(xì)胞。RT-PCR分析顯示，與其他兩組相比，GelMA/AlgMA/HAP組中成骨相關(guān)基因（包括Runx2、Col1A1、OCN和OPN）的表達(dá)水平明顯升高（圖3D）。GelMA/AlgMA組中Runx2、OCN和OPN的表達(dá)水平與GelMA組相比沒有顯著差異。然而，GelMA/AlgMA組中Col1A1的表達(dá)水平顯著升高，與GelMA組相比，這表明AlgMA增強(qiáng)了膠原蛋白的產(chǎn)生。為進(jìn)一步驗(yàn)證成骨相關(guān)蛋白的表達(dá)，進(jìn)行了免疫印跡分析。免疫印跡結(jié)果表明，GelMA/AlgMA/HAP組中成骨相關(guān)蛋白（Runx2、BMP-2和OCN）的表達(dá)顯著高于GelMA和GelMA/AlgMA組（圖3E）。這進(jìn)一步證明了GelMA/AlgMA/HAP不僅在基因水平上促進(jìn)成骨，而且在蛋白水平上能夠增強(qiáng)成骨相關(guān)蛋白的表達(dá)。此外，圖像顯示，GelMA打印的支架邊界更清晰，而GelMA/AlgMA/HAP顯示出更模糊的邊界，表明細(xì)胞在GelMA/AlgMA/HAP生物墨水中生長和擴(kuò)展。這些發(fā)現(xiàn)表明，形成骨器官樣結(jié)構(gòu)的GelMA/AlgMA/HAP生物墨水可以誘導(dǎo)成骨分化和組織重塑。

圖3 生物打印的GelMA、GelMA/AlgMA和GelMA/AlgMA/HAP支架在體外增強(qiáng)了成骨能力

【骨類器官的體外自礦化】

在培養(yǎng)40天期間，使用微CT監(jiān)測（圖4）研究了生物打印的支架在體外礦物質(zhì)形成和成熟過程中的情況。本研究將三組生物三維打印的支架在體外培養(yǎng)20天和40天，并使用微CT進(jìn)行了體外礦化研究（圖4A）。微CT圖像顯示了GelMA、GelMA/AlgMA和GelMA/AlgMA/HAP在20天和40天的礦物質(zhì)形成情況（圖4F-G）。在40天的培養(yǎng)期間，GelMA和GelMA/AlgMA幾乎沒有礦物質(zhì)形成，而GelMA/AlgMA/HAP顯示出大量礦物質(zhì)沉積。因此，體外培養(yǎng)40天的GelMA/AlgMA/HAP生物打印支架被確認(rèn)為骨器官樣結(jié)構(gòu)。在最初的20天內(nèi)，礦化主要發(fā)生在支架的外部。然而，20天后，礦化擴(kuò)展到支架的內(nèi)部。從側(cè)面觀察，礦化組織在支架表面上呈現(xiàn)出比內(nèi)部更均勻的生長。相反，另外兩組在一段時(shí)間后沒有顯示出完整的支架結(jié)構(gòu)。在20至40天期間，只有少數(shù)礦化斑點(diǎn)出現(xiàn)在GelMA和GelMA/AlgMA中，這表明在這些組中自我礦化過程主要發(fā)生在20天后。為評估HAPs的影響，還設(shè)置了一個(gè)對照組，其中包括未加載細(xì)胞的支架材料。然而，這些材料在沒有BMSCs的情況下無法礦化，并且在充分膨脹平衡后在微CT下沒有顯示出高密度信號。經(jīng)過20天浸泡，未加載BMSCs的GelMA/AlgMA/HAP沒有自我礦化。本研究還在時(shí)間上量化了總礦物體積（TMV）和器官樣礦物密度（OMD）（圖4B-C）。在第20天，GelMA/AlgMA/HAP組的TMV顯著高于其他組，而GelMA和GelMA/AlgMA組之間沒有顯著差異。

圖4 GelMA、GelMA/AlgMA生物打印支架以及GelMA/AlgMA/HAP生物打印骨器官樣結(jié)構(gòu)在體外表現(xiàn)出自我礦化能力

【體內(nèi)骨類器官的形成和自我礦化】

為進(jìn)一步研究它們在體內(nèi)重塑成大型和成熟的骨組織的能力，本研究通過在裸鼠皮下植入驗(yàn)證了它們在體內(nèi)骨器官樣結(jié)構(gòu)形成中的應(yīng)用。為更準(zhǔn)確地模擬體內(nèi)細(xì)胞生長微環(huán)境，在體外培養(yǎng)三天后將三維生物打印的水凝膠支架皮下植入裸鼠體內(nèi)。在不同的時(shí)間點(diǎn)評估支架的自我礦化和骨器官樣結(jié)構(gòu)形成（圖5A）。使用HE染色的組織切片進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)生物打印的支架內(nèi)存在各種細(xì)胞類型（圖5B）。這表明BMSCs的有效分化。對于GelMA和GelMA/AlgMA，一個(gè)有趣的發(fā)現(xiàn)是，特別是在支架的中心區(qū)域，某些區(qū)域保持相對完整，表明缺乏細(xì)胞。在這些組中，細(xì)胞主要分布在支架的邊緣。與之形成鮮明對比的是，在GelMA/AlgMA/HAP中，細(xì)胞表現(xiàn)出在整個(gè)支架上均勻擴(kuò)散的顯著能力。本研究對關(guān)鍵骨相關(guān)因子和骨基質(zhì)的關(guān)鍵成分（如OCN、OPN和Runx2）進(jìn)行了特定的免疫染色。這些分析揭示了GelMA/AlgMA/HAP組中強(qiáng)大的骨形成能力，突顯了GelMA/AlgMA/HAP支持皮下骨發(fā)育的能力。相比之下，在GelMA和GelMA/AlgMA中，OPN和Runx2的表達(dá)主要在培養(yǎng)40天后增加（圖5C）。重要的是，在20天時(shí)間點(diǎn)上，這些組中OPN和Runx2的表達(dá)水平顯著低于GelMA/AlgMA/HAP骨器官樣結(jié)構(gòu)。免疫組織化學(xué)的定量數(shù)據(jù)顯示，與GelMA和GelMA/AlgMA相比，GelMA/AlgMA/HAP中成骨蛋白（OCN、OPN和Runx2）的表達(dá)顯著增加（圖5D-F）。

圖5 GelMA、GelMA/AlgMA生物打印支架以及GelMA/AlgMA/HAP生物打印骨器官樣結(jié)構(gòu)在體內(nèi)增強(qiáng)了成骨能力

定量數(shù)據(jù)證實(shí)了本研究的視覺觀察。為進(jìn)一步證實(shí)BMSCs的分化，對膠原II、危險(xiǎn)脂肪素和骨膜素等標(biāo)記物進(jìn)行了免疫熒光染色（圖6A-B）。GelMA/AlgMA/HAP中存在危險(xiǎn)脂肪素+和骨膜素+細(xì)胞，證實(shí)了脂肪組織和成骨細(xì)胞的存在。相反，在另外兩組中，在20天和40天時(shí)這些差異幾乎不可觀察到。GelMA/AlgMA/HAP的免疫熒光染色結(jié)果顯示膠原II呈陽性，表明軟骨細(xì)胞的存在。與20天的體內(nèi)培養(yǎng)相比，40天的熒光強(qiáng)度明顯較弱，這表明GelMA/AlgMA/HAP中的骨化可能是通過內(nèi)生軟骨骨化進(jìn)行的，定量熒光數(shù)據(jù)證實(shí)了這些觀察結(jié)果（圖6C-E）。

圖6 GelMA、GelMA/AlgMA生物打印支架以及GelMA/AlgMA/HAP生物打印骨器官樣結(jié)構(gòu)在體內(nèi)形成，并展現(xiàn)多細(xì)胞分化的能力

根據(jù)免疫熒光染色的結(jié)果，本研究將在體內(nèi)培養(yǎng)20天的GelMA/AlgMA/HAP生物打印支架描述為“骨器官樣結(jié)構(gòu)”。本研究3D打印了水凝膠支架并將其皮下植入裸鼠體內(nèi)，分別培養(yǎng)了20天和40天，然后進(jìn)行了微CT研究體內(nèi)的自我礦化（圖7A）。羥基磷灰石生物打印支架在體內(nèi)培養(yǎng)40天后保持其結(jié)構(gòu)，并發(fā)展成為白色骨狀結(jié)構(gòu)（圖7D-E）。相比之下，GelMA和GelMA/AlgMA呈軟骨狀結(jié)構(gòu)。此外，GelMA/AlgMA和GelMA/AlgMA/HAP的表面上有更多的血管比GelMA。利用微CT評估了生物打印支架的礦化和骨體積（圖7F）。微CT重建清楚地顯示出GelMA/AlgMA/HAP生物打印的骨器官樣結(jié)構(gòu)發(fā)生了礦化，特別是在20天的體內(nèi)培養(yǎng)后，骨樣基質(zhì)在邊緣區(qū)域積累更多。相比之下，另外兩組沒有顯示出礦化。在培養(yǎng)40天后，通過微CT觀察到了GelMA/AlgMA/HAP打印的骨器官樣結(jié)構(gòu)的整個(gè)結(jié)構(gòu)，包括多孔的結(jié)構(gòu)（圖7G）。在體內(nèi)自我礦化研究中，本研究量化了TMV和OMD隨時(shí)間的變化。在20天和40天時(shí)，GelMA/AlgMA/HAP的TMV和OMD顯著高于其他組，而GelMA和GelMA/AlgMA之間沒有顯著差異（圖7B-C）。

圖7 GelMA、GelMA/AlgMA生物打印支架和GelMA/AlgMA/HAP生物打印骨器官樣結(jié)構(gòu)在體內(nèi)表現(xiàn)出自我礦化能力

2. 總結(jié)與展望

總之，本研究成功地使用BMSCs在GelMA/AlgMA/HAP生物墨水中進(jìn)行了大規(guī)模3D骨器官樣結(jié)構(gòu)的生物打印。這些生物墨水為封裝的BMSCs提供了有利的環(huán)境，促進(jìn)其活躍功能和自我礦化。在體內(nèi)環(huán)境中，這些生物打印的骨器官樣結(jié)構(gòu)有效地引導(dǎo)骨生成、礦化、細(xì)胞層形成、塑性和重塑，最終促進(jìn)了骨器官樣結(jié)構(gòu)的發(fā)展。與實(shí)際骨組織，尤其是松質(zhì)骨相比，本研究構(gòu)建的骨器官樣結(jié)構(gòu)具有類似松質(zhì)骨的微觀和納米級多孔結(jié)構(gòu)，明顯的羥基磷灰石晶相，實(shí)現(xiàn)了全面的結(jié)構(gòu)模擬。在機(jī)械性能方面，與當(dāng)前的水凝膠構(gòu)建相比，本研究將構(gòu)建的骨器官樣結(jié)構(gòu)的機(jī)械強(qiáng)度提高了三個(gè)數(shù)量級，達(dá)到了GPa級，與SD大鼠的皮質(zhì)骨沒有顯著差異。有趣的是，通過組織清除技術(shù)，本研究構(gòu)建的骨器官樣結(jié)構(gòu)形成了類似網(wǎng)絡(luò)狀的血管腔。這項(xiàng)研究突顯了使用GelMA/AlgMA/HAP骨器官樣結(jié)構(gòu)通過3D生物打印創(chuàng)建功能化和簡化的骨修復(fù)生物框架的潛力。通過認(rèn)識和解決骨器官樣結(jié)構(gòu)構(gòu)建的獨(dú)特需求和挑戰(zhàn)，研究人員可以在選擇合適的基質(zhì)材料和生物墨水時(shí)做出明智的選擇，從而推動骨組織工程和再生醫(yī)學(xué)之間的界限。隨著我們繼續(xù)應(yīng)對骨微環(huán)境的復(fù)雜性，未來可能會設(shè)計(jì)出大規(guī)模、功能增強(qiáng)的骨器官樣結(jié)構(gòu)，能夠精確調(diào)控干細(xì)胞行為的多個(gè)方面，推動生物材料在骨組織再生方面的應(yīng)用。

文章來源：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adma.202309875