《Science Advances》：3D打印生物活性纖維增強水凝膠助力肌腱再生

來源： EngineeringForLife

肌腱連接處（MTJ）是位于肌肉和肌腱交界處的一種復雜而特殊的組織，負責將力量從收縮的骨骼肌通過肌腱傳遞到骨骼。作為肌肉和肌腱的交界處，MTJ 在日常運動或鍛煉中的重復負荷下承受著集中的機械應力，因此，MTJ 的損傷非常普遍。據(jù)報道，28% 的肌肉-肌腱-骨骼復合體損傷發(fā)生在 MTJ，其風險在肌肉、肌腱、肌肉-肌腱界面和肌腱-骨骼界面損傷中位居第二。目前臨床上治療 MTJ 損傷的方法包括非甾體抗炎藥和物理療法等保守療法，以及使用各種縫合技術(shù)進行手術(shù)干預。然而，其有效性受到以下幾個方面的限制：(i)瘢痕組織的形成導致機械強度不足，導致治療后復發(fā)率較高；(ii)MTJ 損傷處或附近的縫合切口，經(jīng)常導致 MTJ 重建失��；(iii)大面積 MTJ 缺損的修復具有挑戰(zhàn)性，尤其是在肌肉和肌腱損傷后回縮的情況下。因此，目前的干預措施無法同時促進 MTJ 的結(jié)構(gòu)和功能修復，因此有必要開發(fā)前景廣闊的高質(zhì)量 MTJ 再生策略。

來自南京醫(yī)科大學的姚慶強團隊與來自東南大學的張薇等團隊合作開發(fā)了一種含有間充質(zhì)干細胞和 Klotho 的3D打印生物活性纖維增強水凝膠，用于 MTJ 的結(jié)構(gòu)和功能再生。在大鼠MTJ缺損模型中，生物活性纖維增強水凝膠促進了肌肉、肌腱和肌肉-肌腱界面的結(jié)構(gòu)恢復，并增強了損傷MTJ的功能恢復。體內(nèi)蛋白質(zhì)組學和體外細胞培養(yǎng)闡明了生物活性纖維增強水凝膠通過調(diào)節(jié)氧化應激和炎癥反應的再生機制，從而設計出一種優(yōu)化的微環(huán)境來支持移植間充質(zhì)干細胞的存活和分化，并維持 MTJ 組織內(nèi)常駐細胞（包括肌腱/肌肉細胞和巨噬細胞）的功能表型。這種策略為治療 MTJ 損傷提供了一種前景廣闊的方法。相關工作以題為“Bioactive fiber-reinforced hydrogel to tailor cell microenvironment for structural and functional regeneration of myotendinous junction”的文章發(fā)表在2024年04月24日的國際頂級期刊《Science Advances》。

1. 創(chuàng)新型研究內(nèi)容

本研究開發(fā)了一種3D打印纖維增強多功能水凝膠，為MTJ的結(jié)構(gòu)和功能再生提供足夠的機械支持和定制合適的微環(huán)境（圖1A）。在這種生物活性纖維增強水凝膠系統(tǒng)中，3D打印聚（乳酸-共聚-乙醇）酸（PLGA）支架具有良好的排列結(jié)構(gòu)，可為MTJ的生理功能提供足夠的機械強度；間充質(zhì)干細胞的引入可增強肌肉和肌腱的促再生生物活性，Klotho的負載可改善MTJ損傷后外源性間充質(zhì)干細胞和內(nèi)源性MTJ駐留細胞的病理環(huán)境；此外，將光交聯(lián)甲基丙烯酰絲纖維素（SilMA）水凝膠融合到 PLGA 支架中，作為輸送 Klotho 的載體，并為間充質(zhì)干細胞的保留和存活提供3D富水微環(huán)境。本研究首先評估了生物活性纖維增強水凝膠的理化性質(zhì)和細胞相容性。隨后，將水凝膠系統(tǒng)植入大鼠 MTJ 缺陷模型，以評估其在促進 MTJ 結(jié)構(gòu)和功能再生方面的原位功效。進行了體內(nèi)蛋白質(zhì)組學分析，以揭示水凝膠系統(tǒng)促進 MTJ 再生的內(nèi)在機制。根據(jù)蛋白質(zhì)組學結(jié)果，進行了進一步研究，探討通過水凝膠系統(tǒng)操縱細胞微環(huán)境是否以及如何調(diào)節(jié)移植間充質(zhì)干細胞和常駐細胞的行為，從而促進 MTJ 再生。

【制備生物活性纖維增強水凝膠并對其進行表征】

為MTJ再生設計一種具有足夠機械強度和再生生物活性的理想組織工程支架，本研究開發(fā)了一種負載間充質(zhì)干細胞和 Klotho 的 PLGA 纖維增強 SilMA 水凝膠（圖 1A）。利用熔融沉積建模（FDM）3D打印技術(shù)，制作了具有正交排列網(wǎng)格和相互連接的大孔的 PLGA 支架，為受傷的 MTJ 的力傳導和組織生長提供機械和結(jié)構(gòu)支持。隨后，將 SilMA 前體、間充質(zhì)干細胞和重組 Klotho 的混合物融合到 PLGA 支架中，并通過光交聯(lián)形成具有微孔和互連結(jié)構(gòu)的纖維增強水凝膠。作為間充質(zhì)干細胞和生物活性分子的多功能載體，SilMA 水凝膠的引入提高了間充質(zhì)干細胞的保留率，為細胞生長和營養(yǎng)交換建立了有利的3D微環(huán)境，并有效地充當了 Klotho 的釋放系統(tǒng)。掃描電子顯微鏡（SEM）圖像顯示，微孔 SilMA 水凝膠滲入大孔 PLGA 支架的間隙中，從而提供了有利于細胞粘附的更佳微環(huán)境（圖 1B）。PLGA（PA）、SilMA-PLGA（SM-PA）和 Klotho@SilMA-PLGA （K@SM-PA）支架的 PLGA 纖維直徑約為 340 μm（圖 1C）。此外，SM-PA 和 K@SM-PA 支架的孔面積沒有明顯差異，表明 Klotho 的加入對 SilMA 水凝膠的微孔結(jié)構(gòu)沒有顯著影響（圖 1D）。對播種了間充質(zhì)干細胞的纖維增強水凝膠進行的掃描電鏡分析表明，間充質(zhì)干細胞以球形或紡錘形形態(tài)包埋在 SilMA 水凝膠基質(zhì)中。

圖1 生物活性纖維增強水凝膠的制造與表征

【生物活性纖維增強水凝膠能有效促進大鼠 MTJ 的結(jié)構(gòu)和功能再生】

利用大鼠 MTJ 缺損模型評估了本研究的生物活性纖維增強水凝膠對 MTJ 再生的功效（圖 2A）。未經(jīng)處理的 MTJ 缺損設為對照組。植入 4 周后，對 MTJ 缺損處的再生組織進行組織學檢查。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，術(shù)后 4 周時，殘留支架占據(jù)了再生組織的一定空間，阻礙了典型 MTJ 結(jié)構(gòu)的清晰呈現(xiàn)。因此，位于缺損處和鄰近支架的修復組織被用來評估 MTJ 修復情況。血紅素和伊紅（H&E）以及馬森三色染色顯示，M@SM-PA 組和 K/M@SM-PA 組再生的 MTJ 組織顯示出肌肉和肌腱纖維的廣泛插入，并有明顯的相互交錯，而 Ctrl 組和 SM-PA 組的組織則顯示出罕見、不規(guī)則和短的相互交錯（圖 2B 和 C）。還觀察到 M@SM-PA 和 K/M@SM-PA 水凝膠比 Ctrl 和 SM-PA 支架能誘導形成更有組織的肌腱纖維，K/M@SM-PA 組的肌腱膠原纖維呈原生波浪狀（圖2B 和 C）。定量分析顯示，與其他三組相比，K/M@SM-PA 組的肌腱組織學評分明顯較低，表明其形成的組織更像肌腱（圖 2G）。在再生肌肉組織方面，K/M@SM-PA 組與 Ctrl、SM-PA 和 M@SM-PA 組相比，肌纖維直徑明顯增加，表明 K/M@SM-PA 水凝膠促進了肌肉再生（圖 2B、C 和 H）。總之，這些發(fā)現(xiàn)意味著生物活性纖維增強水凝膠在促進 MTJ 組織形成和重塑方面具有很高的功效。

圖2 生物活性纖維增強水凝膠可促進大鼠 MTJ 的結(jié)構(gòu)再生

本研究通過步態(tài)分析和機械測試進一步評估了修復后 MTJ 的功能恢復情況。步態(tài)分析是通過評估行為表型來評估 MTJ 功能的一種可行且無創(chuàng)的方法。如圖 3A 至 C所示，使用實時熒光成像系統(tǒng)捕捉大鼠行走時的爪印。在指定時間點（術(shù)后 1 周、2 周和 4 周）收集大鼠爪印并對步態(tài)參數(shù)進行綜合分析，包括時空參數(shù)（步長、擺動時間和擺動速度）和強度參數(shù)（平均強度、最大接觸平均強度和最大接觸最大強度）（圖 3D 和 E）。隨著疼痛程度的增加，大鼠的行走運動受到不利影響，導致除擺動時間外的所有上述參數(shù)下降。結(jié)果顯示，與正常大鼠相比，術(shù)后 1 周所有組大鼠的步態(tài)均出現(xiàn)異常，步長和步幅明顯減少（圖 3F 和 I 至 K）。從第 1 周到第 4 周，這些參數(shù)逐漸接近甚至超過正常大鼠，其中 K/M@SM-PA 組的恢復最為明顯（圖 3F 至 K）。具體來說，術(shù)后第 2 周，K/M@SM-PA 組的步長和擺動速度值明顯高于 Ctrl 組（P < 0.05）（圖 3F 和 H）。此外，K/M@SM-PA 組大鼠的擺動速度值在術(shù)后 2 周已超過正常大鼠（圖 3H）。在擺動時間方面，K/M@SM-PA組大鼠在術(shù)后1周和2周的擺動時間值最低，表明K/M@SM-PA水凝膠治療后大鼠的行走運動得到了改善，但組間差異不顯著（圖3G）。此外，K/M@SM-PA 組的強度參數(shù)在所有組別中表現(xiàn)出最高水平，包括術(shù)后 4 周的平均強度、最大接觸平均強度和最大接觸最大強度（圖 3I 至 K）。這表明，K/M@SM-PA 治療后，大鼠的站立姿勢更加穩(wěn)定，疼痛減輕。總之，上述步態(tài)分析表明，在植入生物活性纖維增強水凝膠后，MTJ 的功能恢復得到了顯著改善。

圖3 生物活性纖維增強水凝膠促進大鼠 MTJ 的功能恢復

【體內(nèi)蛋白質(zhì)組學揭示生物活性纖維增強水凝膠促進 MTJ 再生的內(nèi)在機制】

為闡明K/M@SM-PA促進MTJ再生的機制，對術(shù)后2周的再生MTJ組織進行了體內(nèi)無標記蛋白質(zhì)組學分析。對來自 M@SM-PA 組和 K/M@SM-PA 組的三個獨立重復序列進行了測序，聚類分析后的差異表達蛋白（DEPs）熱圖顯示，這兩組之間的蛋白表達量存在顯著差異（圖 4A）。主成分分析（PCA）顯示，每組的三個重復品都有明顯的聚類（圖 4B）。如火山圖所示，共鑒定出 937 個蛋白質(zhì)，其中有 193 個上調(diào)的 DEPs 和 553 個下調(diào)的 DEPs（K/M@SM-PA 與 M@SM-PA）（圖 4C）。為深入了解這些DEPs的功能，研究人員進行了基因本體（GO）富集分析，以揭示發(fā)生變化的生物過程（BPs）、細胞成分（CCs）和分子功能（MF）。如圖 4D 所示如圖 4D 所示，上調(diào)的 DEPs（K/M@SM-PA 與 M@SM-PA）富集了幾個與 MTJ 再生高度相關的 GO 術(shù)語，包括 BP 中的 “肌肉系統(tǒng)過程”、“橫紋肌收縮”、“骨骼肌收縮”、“肌肉結(jié)構(gòu)發(fā)育”和“骨骼肌組織發(fā)育”；CC 中的“肌球蛋白復合物”、“錨定連接”、“局灶粘附”和 “肌肉-肌腱連接”；以及 MF 中的“肌肉α-肌動蛋白結(jié)合”。這些術(shù)語大多與骨骼肌的發(fā)育和功能維持有關，表明在纖維增強水凝膠系統(tǒng)中加入Klotho能有效促進MTJ缺損中骨骼肌的再生，這與組織學結(jié)果一致（圖2B、C、F、H和K）。對上調(diào)的 DEPs 進行的 BinGO 分析也顯示了一致的結(jié)果。還發(fā)現(xiàn)了幾個與肌肉-肌腱界面相關的 CC 術(shù)語，包括“錨連接”、“局灶粘附”和“肌腱連接”（圖 4D），這可能與 MTJ 標記表達上調(diào)和肌肉-肌腱整合改善有關（圖 2，D 和 I）。在這些術(shù)語中，“局灶粘附”和“錨連接”是 MTJ 的關鍵組成部分。它們與肌球蛋白的肌動蛋白絲相連，肌動蛋白絲附著在細胞外的層粘連蛋白上，促進了肌纖維與肌腱 ECM 的錨定。然而，可能由于缺乏足夠的肌腱特征標記物，沒有肌腱特異性術(shù)語被富集。為克服 DEP 富集分析的局限性，還對所有鑒定出的蛋白質(zhì)進行了基因組富集分析（GSEA）。結(jié)果顯示，在比較 K/M@SM-PA 和 M@SM-PA 時，多個與肌肉相關的 BP、CC 和 MF 術(shù)語發(fā)生了顯著變化（圖 4E），證實了 Klotho 在促進肌肉再生方面的顯著作用，這與之前的報道一致。

圖4 體內(nèi)全局蛋白質(zhì)組學揭示了生物活性纖維增強水凝膠促進 MTJ 再生的內(nèi)在機制

【生物活性纖維增強型水凝膠可促進細胞存活并支持移植間充質(zhì)干細胞的成腱/成肌分化】

為證實 Klotho- 加入生物活性纖維增強水凝膠對間葉干細胞存活的保護作用，在體外應用 H2O2 和 IL-1β 刺激誘導細胞氧化應激，模擬損傷 MTJ 的病理環(huán)境。采用 2′，7′-二氯熒光素-二乙酸酯（DCFH-DA）測定和定量聚合酶鏈反應（qPCR）來評估水凝膠系統(tǒng)的抗氧化活性。間充質(zhì)干細胞經(jīng)H2O2或IL-1β處理后，H2O2-或IL-1β處理組的ROS陽性細胞較Ctrl組（未經(jīng)H2O2或IL-1β處理）顯著增加，證實H2O2和IL-1β處理能有效促進ROS生成并誘導間充質(zhì)干細胞氧化應激（圖5A和B）。代表性圖像和定量分析顯示，H2O2/IL-1β + K@SM-PA 水凝膠處理的間充質(zhì)干細胞在 H2O2- 和 IL-1β 誘導的 ROS 模型中的 ROS 陽性細胞率分別為 11.71 ± 0.77% 和 23.02 ± 7.63%，明顯低于 H2O2/IL-1β 處理的間充質(zhì)干細胞（H2O2-94.15±1.56%，P＜0.0001；IL-1β為96.67±0.68%，P＜0.0001）和H2O2/IL-1β+SM-PA水凝膠（H2O2為86.05±5.86%，P＜0.0001；IL-1β為96.91±1.93%，P＜0.0001）（圖5A和B）。

qPCR結(jié)果顯示，H2O2刺激后，超氧化物歧化酶-1（SOD-1）、錳依賴性超氧化物歧化酶（MnSOD，又稱SOD-2）和過氧化氫酶（CAT）的表達水平在H2O2組和H2O2+SM-PA組明顯升高（圖5C至E），表明間充質(zhì)干細胞受到的氧化應激增加，激活了其內(nèi)在的抗氧化防御系統(tǒng)。這與之前的一項研究一致，該研究用各種促氧化劑（包括 H2O2、百草枯和甲萘醌）處理 C2C12 肌肉細胞系，發(fā)現(xiàn) C2C12 細胞會激活抗氧化防御系統(tǒng)以應對氧化應激，表現(xiàn)出幾種抗氧化酶的表達顯著增加，包括 MnSOD、CAT、Cu/Zn-超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶。相比之下，與 H2O2 組和 H2O2 + SM-PA 組相比，H2O2 + K@SM-PA 組的間充質(zhì)干細胞在 Klotho 處理后受到的氧化應激水平較低（圖 5C 至 E），SOD-1、SOD-2 和 CAT 的表達明顯降低就是證明。這些結(jié)果表明，負載有 Klotho 的纖維增強水凝膠具有顯著的抗氧化生物活性，能有效清除病理微環(huán)境中的 ROS。

圖5 生物活性纖維增強水凝膠通過抑制氧化應激提高細胞存活率并支持間充質(zhì)干細胞分化

【生物活性纖維增強水凝膠通過抑制氧化應激維持肌母細胞和肌腱干細胞的表型】

本研究的體內(nèi)蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)顯示，K/M@SM-PA水凝膠可以抑制氧化應激和炎癥反應，從而維持內(nèi)源性和外源性細胞的表型和功能，啟動MTJ的再生過程（圖4）。除了移植的間充質(zhì)干細胞外，MTJ 內(nèi)的常駐細胞群也能對生物活性纖維增強水凝膠改善的微環(huán)境做出反應，從而啟動 MTJ 再生的細胞過程。鑒于生物活性纖維增強水凝膠對移植間充質(zhì)干細胞的抗氧化作用已得到證實，本研究將評估范圍擴大到分別代表肌肉和肌腱組織內(nèi)細胞的 C2C12 細胞和肌腱干/祖細胞（TSPCs）（圖 6A）。同樣，C2C12和TSPCs受到H2O2和IL-1β的刺激，并進行DCFH-DA檢測以評估細胞內(nèi)的ROS。當用 H2O2/IL-1β 和 H2O2/IL-1β + SM-PA 處理時，C2C12 和 TSPCs 表現(xiàn)出的 ROS 陽性細胞數(shù)量明顯高于對照組，證實了這兩種細胞中氧化應激的成功誘導（圖 6B 至 E）。研究發(fā)現(xiàn)，與 H2O2 + SM-PA 組相比，H2O2 + K@SM-PA 組的兩類細胞的 ROS 生成量都大大降低（圖 6B 和 C）。C2C12（1.77 ± 1.26% 對 17.44 ± 2.78%，P < 0.05）和 TSPCs（4.66 ± 2.11% 對 55.27 ± 9.93%，P < 0.0001）中的 ROS 陽性細胞率均有所下降（圖 6F 和 G）。此外，在IL-1β刺激模型中，在C2C12和TSPCs中也觀察到了類似但更顯著的效果，與SM-PA水凝膠相比，K@SM-PA水凝膠中C2C12（1.42±0.61%對22.33±3.76%，P＜0.001）和TSPCs（3.80±2.01%對67.28±7.53%，P＜0.0001）的ROS陽性細胞率顯著降低（圖6D、E、H和I）。這些結(jié)果共同證實了所開發(fā)的纖維增強水凝膠對肌肉和肌腱系細胞具有很強的抗氧化能力。

圖6 生物活性纖維增強水凝膠通過抑制氧化應激維持 C2C12 和 TSPC 的功能表型

【生物活性纖維增強水凝膠引導巨噬細胞從促炎表型極化為抗炎表型】

本研究采用了常用的 M1 型巨噬細胞極化誘導劑脂多糖（LPS）（圖 7A）。IF 染色顯示，與 Ctrl 組相比，LPS 刺激可顯著上調(diào)巨噬細胞中誘導型一氧化氮合酶（iNOS）（M1 標志物）的表達水平（P < 0.01），而 CD206 和精氨酸酶-1（ARG-1）（M2 標志物）的表達則明顯下降，證實了 LPS 誘導后巨噬細胞的 M1 極化（圖 7B 至 E）。與 LPS 組（P < 0.05）和 SM-PA 組（P < 0.05）相比，K@SM-PA 組的 iNOS 蛋白表達水平大幅下降（圖 7B 和 E）。相反，與 LPS 組和 SM-PA 組相比，K@SM-PA 組 M2 標志物（CD206 和 ARG-1）的蛋白表達明顯升高，如圖 7（C 至 E）所示。與此相一致，本研究發(fā)現(xiàn) K@SM-PA 水凝膠可部分減輕 LPS 刺激后 CCR-7 表達的增加，而 SM-PA 水凝膠則不能（圖 7F）。同時，與 LPS 組（P < 0.05）和 SM-PA 組（P < 0.05）相比，K@SM-PA 水凝膠誘導的 CD206 表達量明顯增加（圖 7F）。IL-10的表達也有類似的趨勢，但沒有顯著差異（圖7F）。總之，這些結(jié)果表明，Klotho負載的纖維增強水凝膠通過引導巨噬細胞從M1表型極化到M2表型發(fā)揮了抗炎作用。

圖7 生物活性纖維增強型水凝膠引導巨噬細胞從 M1 表型極化到 M2 表型

本研究開發(fā)了一種纖維增強水凝膠，它能為力傳導提供足夠的機械支持，同時具有免疫調(diào)節(jié)和抗氧化生物活性，以改善具有挑戰(zhàn)性的損傷后微環(huán)境，最終調(diào)節(jié)外源性和內(nèi)源性細胞的行為，促進體內(nèi) MTJ 的結(jié)構(gòu)和功能再生（圖 8）。3D打印的 PLGA 支架的排列結(jié)構(gòu)使水凝膠系統(tǒng)具有接近于原生 MTJ 的強大機械性能，可有效支持肌肉-肌腱界面的力傳遞，從而維持 MTJ 再生過程中的生理功能。在水凝膠系統(tǒng)中加入 Klotho 可減輕氧化應激和炎癥反應，從而創(chuàng)造一個有利于再生的微環(huán)境，保護 MTJ 損傷中各種細胞群的功能和表型。它能提高移植間充質(zhì)干細胞的存活率，并支持其多向分化能力，可能有助于在隨后的肌肉和肌腱再生過程中增強肌源性/腱源性分化。此外，改善的微環(huán)境還能維持 MTJ 中常駐肌腱/肌肉細胞的功能表型，并調(diào)節(jié)巨噬細胞向抗炎表型的極化。

圖8 促進 MTJ 再生的生物活性纖維增強水凝膠示意圖

2. 總結(jié)與展望
本研究開發(fā)了一種生物活性纖維增強水凝膠，它具有足夠的機械強度、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)生物活性、干細胞遞送特性和內(nèi)源性細胞調(diào)節(jié)功能，可同時促進MTJ的結(jié)構(gòu)和功能再生。在這種水凝膠系統(tǒng)中，帶有排列整齊纖維的3D打印聚乳酸（PLGA）支架賦予了水凝膠足夠的機械強度，以維持 MTJ 的生理功能。由于 Klotho 的加入抑制了氧化應激，該支架為移植間充質(zhì)干細胞的存活和分化提供了有利的微環(huán)境，同時保持了 TSPCs 和肌母細胞的功能表型特征，從而啟動了 MTJ 的再生過程。此外，它還具有免疫調(diào)節(jié)功能，能使巨噬細胞從促炎的 M1 表型恢復到抗炎的 M2 表型。與以往主要在體外進行的 MTJ 組織工程研究不同，本研究定制了一個優(yōu)化的細胞微環(huán)境，以調(diào)節(jié)體內(nèi)不同的細胞群，從而增強 MTJ 的結(jié)構(gòu)修復和功能恢復。本研究獲得的啟示為未來治療 MTJ 損傷帶來了巨大希望。

文章來源：
https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adm7164