投影式光固化3D打印高仿生支架負(fù)載工程化納米囊泡促進(jìn)大段骨再生

來源： EFL生物3D打印與生物制造

創(chuàng)傷、感染和骨腫瘤切除引起的大段骨缺損再生能力有限，與之相關(guān)的功能喪失嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，因此對大段骨缺損的修復(fù)有著廣泛的需求。目前，用于大段骨修復(fù)的原位仿生支架植入在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域獲得了極大的普及。然而，由于缺乏合適的早期微環(huán)境調(diào)節(jié)能力，利用原位骨仿生支架修復(fù)大型節(jié)段性骨缺損尚未取得重大臨床突破。

來自華中科技大學(xué)的孫家明團(tuán)隊(duì)在骨的天然微通道和皮質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的啟發(fā)下，利用投影式光固化3D打印技術(shù)（EFL-BP8601 Pro）制作了高仿生結(jié)構(gòu)的PCLMA骨支架，該支架具有外層骨皮質(zhì)、內(nèi)層復(fù)雜網(wǎng)狀的松質(zhì)骨、Haversian管和橫向穿透的Volkmann管。隨后通過生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)將脂肪干細(xì)胞來源工程化納米囊泡（ADSC-ENs）穩(wěn)定地負(fù)載到支架表面。該支架為骨缺損區(qū)提供了具有合適活性成分的仿生結(jié)構(gòu)支撐，人工構(gòu)建了缺損區(qū)的局部血管化和成骨微環(huán)境。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該支架具有良好的生物相容性，能顯著促進(jìn)血管生成和成骨過程。相關(guān)工作以題為“Synergistic large segmental bone repair by 3D printed bionic scaffolds and engineered ADSC nanovesicles: Towards an optimized regenerative microenvironment”的文章發(fā)表在2024年4月8日的國際知名期刊《Biomaterials》。

1. 創(chuàng)新型研究內(nèi)容

【工程化納米囊泡的表征與生物素化】

為了獲得高產(chǎn)量的工程化納米囊泡（ENs），作者團(tuán)隊(duì)采用機(jī)械擠壓的方法，分別使用10μm、5μm和1μm孔徑的膜連續(xù)擠壓ADSCs。掃描電子顯微鏡(SEM)顯示ENs的形態(tài)為橢圓形(圖1A)。納米顆粒跟蹤分析(NTA)進(jìn)一步證明，ENs的尺寸在50-150 nm之間，最大峰位于62±1.5 nm，顆粒數(shù)量占總顆粒的86.35%(n=3)(圖1B)。蛋白質(zhì)定量顯示，1×107ADSC獲得的ENs蛋白質(zhì)濃度可達(dá)88.35±6.62μg/mL，而同等數(shù)量ADSC獲得的細(xì)胞外囊泡（EVs）的蛋白質(zhì)濃度僅為2.85±1.04μg/mL(n=3)(圖1C)。對EVs、ENs和細(xì)胞的考馬斯亮藍(lán)分析表明，ENs和細(xì)胞的蛋白質(zhì)濃度具有非常相似的SDS-PAGE圖譜，而EVs的SDS-PAGE圖譜則完全不同(圖1E)。其次，將生物素功能化的1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolaminepoly(乙二醇基)(DSPE-聚乙二醇)(DSPE-聚乙二醇-生物素)用于機(jī)械擠出改性ENs。用FITC標(biāo)記的鏈霉親和素對ENs的修飾結(jié)果進(jìn)行了評估，熒光顯微鏡圖像顯示生物素成功地修飾到ENs上(圖1D)。

圖1 工程化納米囊泡的生表征與生物素化

【PCLMA的表征及材料的表面生物素化】

首先，使用MAAh對三臂聚己內(nèi)酯（PCL）進(jìn)行改性為PCLMA，以滿足PCL材料的光固化性能(圖2A)。用PCLMA樹脂進(jìn)行光交聯(lián)后的光學(xué)圖像表明，MAAh改性的三臂PCL具有光固化能力，在405 nm紫外光照射20 S后達(dá)到穩(wěn)定固化(圖2B)。隨后，利用投影式光固化3D打印技術(shù)對PCLMA的打印性能進(jìn)行了研究，并設(shè)計(jì)了不同的結(jié)構(gòu)進(jìn)行打印精度測試。此外，還使用了微距鏡頭進(jìn)行多角度攝影，以探索印刷細(xì)節(jié)。結(jié)果表明，PCLMA可以以高打印精度打印各種三維結(jié)構(gòu)，紅色箭頭表示PCLMA可以打印高達(dá)100μm(圖2C)。由于在合成PCLMA的過程中，過量的MAAH取代了幾乎所有的末端羥基，仿生支架的表面首先用鹽酸和高錳酸鉀處理，暴露了表面的羥基，然后進(jìn)一步對生物素進(jìn)行修飾，以實(shí)現(xiàn)支架表面的生物素修飾。接下來，生物素在仿生支架的表面被修飾，以允許更好地負(fù)載ENS(圖2D)。仿生骨支架設(shè)計(jì)有中央髓管、外周哈弗管和外側(cè)Volkmann管，以探索其使用PCLMA材料打印的可行性(圖2E)。隨后，用生物素對仿生骨支架進(jìn)行生物素修飾，以用于鏈霉親和素的接枝。最后，在各個(gè)角度下觀察了支架的細(xì)節(jié)，PCLMA支架和生物化支架都具有良好的仿生結(jié)構(gòu)(圖2F)。FT-IR分析表明，與PCLMA相比，經(jīng)HCl/KMnO4處理后得到的PCLMA-OH在3300-3650 cm-1處有一個(gè)峰，表明表面羥基暴露。此外，生物素化的PCLMA(PCLMA-Bio)在1500-1580 cm-1處有一個(gè)微小的峰，與PCLMA-OH相比略有移動，從而證實(shí)了生物素通過EDC/DMAP化學(xué)偶聯(lián)成功地接枝到支架表面。接下來，用FITC標(biāo)記鏈霉親和素，熒光顯微鏡顯示PCLMA-Bio Avidin+與PCLMA相比具有更強(qiáng)的熒光信號，這同樣表明PCLMA成功的生物素化(圖2G)。

圖2 PCLMA的表征及材料的表面生物素化

【ENs在材料表面的穩(wěn)定接枝】

為了驗(yàn)證支架在體外的接枝穩(wěn)定性，在鏈霉親和素存在的情況下，將生物素化的 ADSC-ENs 與生物素化的 PCLMA、PCLMA-OH 和純 PCLMA 共同培養(yǎng)，然后用超聲波清洗器進(jìn)行超聲處理，以測試其機(jī)械穩(wěn)定性（圖 3A）。熒光圖像顯示，隨著超聲處理時(shí)間的延長，ADSC-ENs 的保留率逐漸下降。超聲處理 60 秒后，可在生物素化 PCLMA 上清晰地檢測到紅色熒光標(biāo)記的 ADSC-EN；相比之下，PCLMA-OH 或 PCLMA 上幾乎沒有熒光區(qū)域（圖 3B）。更具體地說，60 秒時(shí) PCLMA-BAS-ENs、PCLMA-OH 和 PCLMA 的熒光面積（像素）分別為 1784.80 ± 259.24、10.00 ± 3.74 和 9.80 ± 3.81（圖 3C）。為了改善復(fù)雜結(jié)構(gòu)支架中的囊泡負(fù)載，作者設(shè)計(jì)了一種具有不同灌注方向的灌注系統(tǒng)，用于在仿生支架上進(jìn)行ENs的接枝，該系統(tǒng)由一個(gè)灌注室、兩個(gè)數(shù)字控制蠕動泵和兩個(gè)介質(zhì)容器組成。設(shè)計(jì)的灌注室由兩部分組成：灌注部分和頂部（圖 3D）。前者由白色感光樹脂制成，用于容納灌注支架，后者由半透明樹脂制成，用于實(shí)時(shí)觀察。灌注部分的中央最多可放置兩根支撐桿，用于固定多個(gè)仿生支架。此外，腔體內(nèi)還有四個(gè)固定釘，用于在打印前分別固定頂部和灌注部分。值得注意的是，灌注部分包含用于與介質(zhì)灌注系統(tǒng)建立連接的孔口，宏觀上分為相互垂直的兩個(gè)方向，所有孔口的直徑均為 2 毫米。為了確定復(fù)雜結(jié)構(gòu)支架中負(fù)載的 ENs 的穩(wěn)定性，使用了超聲波清洗器。掃描電子顯微鏡圖像證實(shí)，超聲處理 30 秒后，灌注接枝組表面的ENs數(shù)量明顯高于未灌注接枝組，而未接枝組表面幾乎沒有ENs殘留（圖 3E），作者推斷灌注裝置顯著提高了ENs在支架表面的接枝效率。灌注接枝組支架不同部位的掃描電子顯微鏡圖像顯示，ENs 在支架表面的所有部位都實(shí)現(xiàn)了均勻高效的負(fù)載，甚至在支架骨髓腔內(nèi)復(fù)雜結(jié)構(gòu)的表面也是如此（圖 3F）。

圖3 ENs在材料表面的穩(wěn)定接枝

【PCLMA-BAS-ENs支架修復(fù)兔骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究】

為了進(jìn)一步驗(yàn)證該策略在臨床應(yīng)用中的潛力，作者采用了兔橈骨原位骨形成試驗(yàn)來分析兩種支架的成骨能力（圖 4A-B），并用生物素-鏈霉親和素法負(fù)載 ENs 的 PCLMA 支架（PCLMA-BAS-ENs 組）和純 PCLMA 支架（PCLMA 組）修復(fù)兔橈骨的大段骨缺損（15 mm 長）。第 1、2 和 3 個(gè)月的活體 CT 成像顯示，三組兔子的骨缺損修復(fù)狀況存在顯著差異，PCLMA-BAS-ENs 組的大部分骨缺損在第 3 個(gè)月時(shí)已經(jīng)修復(fù)，缺損區(qū)域兩側(cè)的骨結(jié)合更完整、更連續(xù)，運(yùn)動和活動功能恢復(fù)正常。第 1、2 和 3 個(gè)月的活體 CT 成像顯示，三組兔子的骨缺損修復(fù)狀況存在顯著差異。到第三個(gè)月時(shí)，PCLMA-BAS-ENs 組的大部分骨缺損已經(jīng)修復(fù)，缺損區(qū)兩側(cè)的骨結(jié)合相對完整，運(yùn)動和活動功能恢復(fù)正常。PCLMA 組僅有一小部分骨組織得到修復(fù)，但仍明顯缺乏骨再生。正如預(yù)期的那樣，未經(jīng)處理的空白組幾乎沒有修復(fù)的跡象（圖 4C）。值得注意的是，定量分析確定PCLMA-BAS-ENs組的大多數(shù)定量指標(biāo)均高于 PCLMA 組和空白對照組，這表明負(fù)載 ENs 的仿生支架所創(chuàng)造的誘導(dǎo)骨微環(huán)境在骨再生中發(fā)揮了重要作用（圖 4D）。與上述檢查結(jié)果一致，12 周時(shí)的組織學(xué)染色顯示，PCLMA-BAS-ENs組整個(gè)骨缺損區(qū)域的骨形成相對完整，有大片可見的未成熟膠原纖維（藍(lán)色區(qū)域）。在 PCLMA 組中，缺損區(qū)中央?yún)^(qū)域可見明顯的骨再生和纖維組織形成，以及不連續(xù)的骨結(jié)合。在未經(jīng)處理的空白組中，缺損區(qū)中央?yún)^(qū)域有明顯的組織缺失區(qū)域（圖 5A-B）。尤其是術(shù)后 12 周時(shí)，PCLMA-BAS-ENs 內(nèi)的內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)育良好且連續(xù)。更重要的是，這些結(jié)果證實(shí)了載入囊泡的仿生骨支架系統(tǒng)促進(jìn)了宿主血管的生長，加速了橈骨的再生。此外，還在植入后 12 周進(jìn)行了免疫組化染色（BMP-2、Runx2 和 OCN），以研究骨再生過程中可能存在的成骨相關(guān)表達(dá)（圖 5C-E）。定量分析顯示，在 PCLMA-BAS-ENs 組中，BMP-2、Runx2 和 OCN 的骨相關(guān)表達(dá)水平均有所提高（圖 5F）�？傊�，這些結(jié)果表明，負(fù)載 ENs 的仿生骨支架可以調(diào)節(jié)體內(nèi)局部成骨微環(huán)境，促進(jìn)骨再生和修復(fù)。

圖4 PCLMA-BAS-ENs支架修復(fù)兔骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究

圖5 第12周時(shí)再生組織的代表性染色圖像

【仿生骨誘導(dǎo)支架對局部成骨微環(huán)境的調(diào)節(jié)】

有研究表明，組織缺損部位局部微環(huán)境調(diào)控的關(guān)鍵時(shí)期是創(chuàng)傷發(fā)生后的三天內(nèi)。作者在第3天收集植入兔子骨缺損部位的支架，包括3個(gè)負(fù)載囊泡的支架（PCLMA-BAS-ENs 組）和3個(gè)裝有純材料的支架（PCLMA 組），并洗脫支架表面的蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析。本研究根據(jù)定量蛋白質(zhì)組學(xué)和 DIA 的顯著性標(biāo)準(zhǔn)（FC > 1.2，P < 0.05）鑒定了857個(gè)上調(diào)蛋白質(zhì)和37個(gè)下調(diào)蛋白質(zhì)，并將數(shù)據(jù)以火山圖（圖 7A）和直方圖（圖 7B）的形式呈現(xiàn)。KEGG 通路分析揭示了差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。更具體地說，前20個(gè)蛋白質(zhì)富集在多個(gè)生物學(xué)過程中，如氧化磷酸化、cAMP 信號通路、cGMP-PKG 信號通路、白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移、趨化因子信號通路等（圖 7C）。同時(shí)，GO 富集分析表明，差異蛋白參與了細(xì)胞對干擾素-γ 的反應(yīng)、氧化還原過程、正趨化作用、對表皮生長因子的反應(yīng)、中性粒細(xì)胞趨化作用的正調(diào)控等（圖 7D-F）。為了進(jìn)一步闡明仿生支架促進(jìn)成骨的細(xì)胞學(xué)機(jī)制，分別在第3天和第7天對 PCLMA-BAS-ENs 組和 PCLMA 組（n = 6）進(jìn)行了免疫熒光染色，定量結(jié)果顯示，在第7天、 M1型巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記物CD86在PCLMA-BAS-ENs組的表達(dá)水平低于PCLMA組，而M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記物CD163在PCLMA組的表達(dá)水平低于PCLMA組。此外，在第 7 天，PCLMA-BAS-ENs 組的 rBMSC 相關(guān)標(biāo)記物 CD44 和 CD29 的表達(dá)水平也明顯高于 PCLMA 組，而且可以明顯觀察到骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聚集（圖 6A 和 B）。

圖6 仿生骨誘導(dǎo)支架的免疫調(diào)節(jié)和干細(xì)胞募集

圖7 仿生骨誘導(dǎo)支架對局部成骨微環(huán)境的影響的調(diào)控機(jī)制

2. 總結(jié)與展望
本研究成功地利用投影式光固化3D打印技術(shù)制備了高精度的仿生骨支架，并通過灌流裝置將生物素標(biāo)記的ENs移植到其上。這種精心設(shè)計(jì)的仿生支架負(fù)載豐富的工程化納米囊泡，建立了一個(gè)有利于成骨的微環(huán)境。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了其促進(jìn)大段骨缺損修復(fù)的能力，可歸因于其早期的免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)血管生成和促進(jìn)成骨反應(yīng)。因此，本研究為功能化高精度仿生支架的研究提供了一種有前景的策略，為骨缺損微環(huán)境的局部調(diào)控鋪平了道路。

文章來源：
https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2024.122566