如何利用功能性墨水設(shè)計(jì)和生物3D打印技術(shù)來實(shí)現(xiàn)半月板損傷修復(fù)？

來源： EngineeringForLife

半月板損傷是運(yùn)動醫(yī)學(xué)領(lǐng)域面臨的一大挑戰(zhàn)，常因膝關(guān)節(jié)受力分布異常、潤滑降低及穩(wěn)定性下降導(dǎo)致軟骨退化，最終可能發(fā)展為骨關(guān)節(jié)炎。由于半月板自愈能力弱，修復(fù)難度大，現(xiàn)有治療如移植、切除或縫合術(shù)無法根本阻止疾病進(jìn)程。這突顯出尋找有效治療手段的緊迫性。隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展，為半月板損傷的修復(fù)與重建提供了新的思路，尤其是在復(fù)制半月板自然異質(zhì)性方面的探索，成為當(dāng)前研究的重點(diǎn)。

本期，EFL以發(fā)表在雜志《Chemical Engineering Journal》上的“Regional specific tunable meniscus decellularized extracellular matrix (MdECM) reinforced bioink promotes anistropic meniscus regeneration”研究為例，介紹了3D打印技術(shù)結(jié)合復(fù)合型墨水構(gòu)建，可制備具有分區(qū)微結(jié)構(gòu)的支架，以促進(jìn)半月板再生和軟骨保護(hù)。該支架模擬了半月板的自然異質(zhì)性，通過特定區(qū)域的細(xì)胞分化和外基質(zhì)沉積，實(shí)現(xiàn)了各自區(qū)域功能的顯著增強(qiáng)，促進(jìn)了各向異性的半月板再生，表明該方法在運(yùn)動醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中具有潛在的應(yīng)用價值。

1. 本文生物墨水是如何制備的？

➢ GelMA/HAMA水凝膠的配制

利用10%（w/v）的甲基丙烯�；�明膠（GelMA）和2%（w/v）的甲基丙烯酰化透明質(zhì)酸（HAMA）配制光交聯(lián)水凝膠：將GelMA粉末溶于磷酸鹽緩沖液（PBS）并加熱至完全溶解，隨后加入HAMA粉末和0.5%（w/v）的光引發(fā)劑（LAP），混合均勻。


➢ MdECM整合與生物活性因子添加
將半月板脫細(xì)胞外基質(zhì)（MdECM）粉末以2%（w/v）的比例加入到GelMA/HAMA混合物中，以實(shí)現(xiàn)區(qū)域特定的細(xì)胞誘導(dǎo)。為了進(jìn)一步促進(jìn)特定區(qū)域的細(xì)胞分化，向內(nèi)部區(qū)域的生物墨水中添加10 ng/mL的轉(zhuǎn)化生長因子β3（TGF-β3），向外部區(qū)域的生物墨水中添加100 ng/mL的結(jié)締組織生長因子（CTGF）。

➢ 生物墨水的優(yōu)化
通過調(diào)整GelMA和HAMA的比例、MdECM的加入量、以及生物活性因子的濃度，優(yōu)化生物墨水的物理和化學(xué)性質(zhì)。這些參數(shù)的精確控制，旨在提高生物墨水的凝膠化性能、粘度和最終構(gòu)件的機(jī)械強(qiáng)度，以適應(yīng)不同的三維打印需求和生物學(xué)應(yīng)用。

2. 如何利用載缺氧預(yù)處理的軟骨祖細(xì)胞的GelMA微球治療骨關(guān)節(jié)炎？

圖1 本文的研究示意圖

1）光交聯(lián)生物墨水的制備與表征
本文首先從豬半月板中成功提取了區(qū)域特定的MdECM。實(shí)驗(yàn)對半月板內(nèi)外區(qū)域進(jìn)行了分離和脫細(xì)胞處理，旨在去除細(xì)胞成分同時保留外基質(zhì)結(jié)構(gòu)和重要成分如膠原蛋白和糖胺聚糖（GAGs）。隨后，通過凍干和研磨過程，將處理后的組織轉(zhuǎn)化為細(xì)小的MdECM粉末。該過程不僅驗(yàn)證了脫細(xì)胞方法的有效性，還確保了保留了半月板內(nèi)外區(qū)域的生物化學(xué)特性和生物活性，為后續(xù)生物墨水的制備和半月板組織工程的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

圖2 區(qū)域特異性的MdECM制備和表征

2）區(qū)域特異性MdECM生物油墨的制備與表征
作者基于MdECM開發(fā)了一種模擬半月板自然異質(zhì)性的生物墨水。通過將來自半月板內(nèi)外不同區(qū)域的MdECM與GelMA和HAMA水凝膠結(jié)合，制備了四種不同濃度的MdECM基生物墨水（G10H0, G10H1, G10H2, 和G10H3），旨在發(fā)現(xiàn)最適合細(xì)胞生長和精確3D打印的配比。不同配比的水凝膠在紫外線照射下30秒內(nèi)能夠快速凝膠化，且隨著MdECM的加入，墨水由透明轉(zhuǎn)為不透明，這一變化可能有助于提高細(xì)胞附著和生長。通過FTIR分析，確認(rèn)了生物墨水中GH和MdECM成分的均一性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，特別是在870 cm-1處觀察到的C-OH鍵伸展峰，表明了成功的材料混合。

流變學(xué)性質(zhì)的評估表明，所有生物墨水都展現(xiàn)出剪切稀化行為，這對于通過3D打印技術(shù)精確構(gòu)建支架結(jié)構(gòu)極為重要。特別地，G10H3組表現(xiàn)出更高的彈性模量，指示其可能更適合支撐細(xì)胞生長的結(jié)構(gòu)。此外，CTGF和TGF-β3的緩慢且持續(xù)的釋放曲線強(qiáng)調(diào)了這些生物墨水能夠長時間在細(xì)胞微環(huán)境中提供生長因子，促進(jìn)特定類型的細(xì)胞分化。通過對支架的微觀結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，模擬了半月板的自然微結(jié)構(gòu)，其中外部區(qū)域的纖維設(shè)計(jì)為松散和大孔徑，而內(nèi)部區(qū)域的纖維緊密且孔徑較小，有助于模擬半月板內(nèi)外不同區(qū)域的物理和生物功能。

圖3 區(qū)域特異性MdECM生物墨水的表征

3）區(qū)域特異性生物墨水增強(qiáng)支架的生物學(xué)評價
作者進(jìn)行了區(qū)域特異性生物墨水增強(qiáng)支架的生物學(xué)評價。細(xì)胞活力測試的結(jié)果顯示，無論是外部還是內(nèi)部區(qū)域的生物墨水，都沒有顯示出細(xì)胞毒性，證明了這些生物模擬生物墨水具有滿意的細(xì)胞相容性。為了成功復(fù)制半月板的自然形態(tài)和各向異性結(jié)構(gòu)，向細(xì)胞環(huán)境中提供適當(dāng)?shù)男盘�，包括生化刺激，是至關(guān)重要的。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β3能夠提高軟骨基因（如COL2A1、ACAN和SOX9）的表達(dá)水平，而CTGF能夠在正確刺激下增加纖維軟骨基因（如COL1A1、FN1和TNC）的表達(dá)水平。此外，通過組織特異性熒光標(biāo)記的分析顯示，與對照組（PG組）相比，PGEF組在內(nèi)部區(qū)域展現(xiàn)了更高水平的II型膠原（Col II）表達(dá)，在外部區(qū)域展現(xiàn)了更高水平的I型膠原（Col-I）表達(dá)。實(shí)時定量聚合酶鏈反應(yīng)（q-PCR）的結(jié)果進(jìn)一步證明了在PGEF組中，無論是軟骨基因（COL II、ACAN和SOX 9）還是纖維生成基因（COL I、FN1和TNC）的表達(dá)都顯著高于對應(yīng)的對照組。結(jié)果表明，所開發(fā)的生物模擬水凝膠具有明顯的組織特異性調(diào)節(jié)活動，能夠成功模擬軟骨和纖維生成微環(huán)境。因此，PGEF被證實(shí)具有誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行各向異性纖維軟骨分化以及體外特定區(qū)域細(xì)胞外基質(zhì)生成的能力。

圖4 區(qū)域特異性生物墨水增強(qiáng)支架的生物相容性

4）評價再生半月板對軟骨的保護(hù)作用
➀體內(nèi)再生半月板的宏觀觀察、MRI和生物力學(xué)評價
該研究進(jìn)行了半月板再生的評估，在將特定區(qū)域的MdECM增強(qiáng)構(gòu)造體植入兔膝關(guān)節(jié)后進(jìn)行的。通過使用MRI分析在冠狀面和矢狀面上評估各個組中的組織形態(tài)生成。結(jié)果顯示，在24周時所有組都可見到新生半月板，PGEF組顯示的再生組織在形狀和輪廓上更接近自然半月板。此外，PGEF組的WORMS評分顯著低于其他組，類似于自然半月板，從而突顯出PGEF支架的卓越再生效果。再生構(gòu)造體的一般形態(tài)在24周后展現(xiàn)，其中PGEF組展示了更完整、更均勻的再生半月板，與關(guān)節(jié)整合性更好。

為了評估力學(xué)的各向異性，進(jìn)行了各種拉伸測試，包括內(nèi)外區(qū)域的徑向和周向的減小和雙向拉伸測試，并分析了前角和后角的最終拉伸強(qiáng)度。在進(jìn)行了24周的體內(nèi)測試后，觀察到PGEF組展現(xiàn)了特定區(qū)域（內(nèi)部與外部）在周向拉伸模量和減少模量方面的差異。然而，就減少模量和雙向拉伸模量而言，PGEF組與自然組在兩個區(qū)域之間不再存在差異。此外，PGEF組的徑向拉伸和最終拉伸強(qiáng)度超過了對照組，更類似于自然組。

圖5 體內(nèi)再生半月板的宏觀觀察、MRI和生物力學(xué)評價

➁體內(nèi)再生半月板的組織學(xué)評價
進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，PGEF組的組織學(xué)評估顯示了更具區(qū)域特異性的細(xì)胞表型和細(xì)胞外基質(zhì)沉積分布，這與自然半月板非常相似。內(nèi)部區(qū)域展示了由COL-2和蛋白多糖組成的軟骨基質(zhì)，而外部區(qū)域顯示了以COL-1為特征的排列有序的纖維基質(zhì)。半定量研究和免疫組化揭示了從外部區(qū)域到內(nèi)部區(qū)域COL 1的強(qiáng)度降低，而COL 2的強(qiáng)度相應(yīng)增加。這種生化組成與自然半月板相似，其中外部區(qū)域主要是COL-1，而內(nèi)部區(qū)域的膠原蛋白大部分是COL 2。PGEF組再生的半月板組織的組織學(xué)結(jié)果顯示了特定區(qū)域的細(xì)胞表型，類似于自然半月板的ECM的各向異性組織，相比之下，對照組沒有顯示出差異性的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。此外，PGEF組的內(nèi)部區(qū)域有許多球形的軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞，而外部區(qū)域則以梭形的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞為主，從而類似于半月板的自然結(jié)構(gòu)。

圖6 體內(nèi)再生半月板的組織學(xué)評價

5）區(qū)域特異性MdECM基半月板增強(qiáng)結(jié)構(gòu)對軟骨的保護(hù)作用
同時，研究也討論了再生半月板對軟骨的保護(hù)效果。通過對關(guān)節(jié)軟骨的整體觀察，與其他組相比，PGEF組在每個時間點(diǎn)上顯示出較少的軟骨退化，這一點(diǎn)也得到了組織學(xué)檢查的支持。具體來說，在對照組中，股骨髁和脛骨平臺的關(guān)節(jié)軟骨顯示出相當(dāng)大的失序，并在甲苯胺藍(lán)染色和SO染色中顯現(xiàn)淺色。根據(jù)國際軟骨修復(fù)學(xué)會（ICRS）評分和曼金斯評分，對照組的軟骨損傷更為嚴(yán)重。相反，PGEF組展示出比對照組更優(yōu)越的軟骨保護(hù)能力，根據(jù)組織學(xué)染色，PGEF組中沒有明顯的軟骨退化和裂縫。這些發(fā)現(xiàn)表明，特定區(qū)域的MdECM增強(qiáng)支架不僅實(shí)現(xiàn)了生物功能的各向異性仿生學(xué)，而且還促進(jìn)了機(jī)械恢復(fù)。

圖7 體內(nèi)軟骨的組織學(xué)評估

3. 本文的創(chuàng)新點(diǎn)
本研究的主要創(chuàng)新在于開發(fā)了一種基于區(qū)域特定脫細(xì)胞外基質(zhì)（MdECM）的生物墨水，結(jié)合GelMA和HAMA水凝膠制備過程。這種生物墨水不僅模擬了半月板的自然異質(zhì)性，而且通過精確控制生物活性因子TGF-β3和CTGF的釋放，創(chuàng)新地促進(jìn)了特定區(qū)域細(xì)胞的特化分化。此外，研究首次利用三維打印技術(shù)與MdECM相結(jié)合，精確構(gòu)建了模擬自然半月板結(jié)構(gòu)和功能的組織工程支架，為復(fù)雜組織的再生和修復(fù)提供了新策略。

4. 總結(jié)
本研究成功證明了MdECM基GelMA/HAMA生物墨水在模擬半月板自然異質(zhì)性和促進(jìn)特定細(xì)胞分化方面的有效性。通過結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和打印性能的優(yōu)異表現(xiàn)，以及生物活性因子的長期穩(wěn)定釋放，這種生物墨水為半月板損傷的修復(fù)和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域提供了有力的材料基礎(chǔ)。體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了其在促進(jìn)細(xì)胞特定類型分化和組織再生方面的潛力，展示了利用三維打印技術(shù)精確構(gòu)建半月板組織工程支架的前景。

文獻(xiàn)來源：
https://doi.org/10.1016/j.cej.2023.145209