3D生物打印神經組織支架用于脊髓損傷修復

神經干細胞（NSCs）移植可以實現部分神經回路和功能的重建，是脊髓損傷(SCI)一種極具前景的治療方式。然而直接移植到病變部位的NSCs存活率低，分化易失控。3D生物打印可以構建NSCs分布均勻且具有精確而又復雜的脊髓樣結構的載細胞支架，有望為NCSs提供了合適的微環(huán)境并促進病變區(qū)域的細胞-支架和細胞-細胞相互作用，這對外源性NSCs在體內進行神經元再生和軸突連接意義重大。

近期，中科院蘇州納米技術與納米仿生研究所的張智軍教授團隊開發(fā)了一種可用于制造載NSCs神經組織支架的3D生物打印策略。打印的支架能為NSCs的生長和神經分化提供良好的微環(huán)境、促進軸突再生、減少膠質疤痕形成以及優(yōu)化神經網絡的形成，最終能幫助恢復SCI模型大鼠的運動能力，實現SCI修復。相關成果 “3D bioprinted neural tissue constructs for spinal cord injury repair”發(fā)表于Biomaterials上。

圖1 HBC/HA/MA生物墨水3D打印前后的交聯反應以及載NSCs神經組織支架的3D生物打印示意圖

生物墨水組成：羥丙基殼聚糖(HBC)、巰基化透明質酸(HA-SH)、乙烯砜化透明質酸(HA-VS)和基質膠（matrigel ，MA)

工藝：HBC/HA-SH/MA與HA-VS溶液冰浴混勻后得到HBC/HA/MA-0.3生物墨水(HBC 3% w/v, HA-SH0.3% w/v, HA-VS 0.3% w/v, MA 0.1% w/v) 或者BC/HA/MA-0.6生物墨水(HBC 3% w/v, HA-SH0.6% w/v, HA-VS 0.6% w/v, MA 0.1% w/v)。將HBC/HA/MA生物墨水置于37℃放置2h，即交聯形成HBC/HA/MA水凝膠；NSCs與HBC/HA/MA生物墨水混合冰浴5min則可獲得載細胞的生物墨水。

3D生物打印條件：擠出式生物3D打印法；注射器溫度10℃，打印平臺溫度37℃，打印壓力約20 kPa

1. HBC/HA/MA生物墨水的表征

1）剪切變稀特性、凝膠速度以及機械強度表征
HBC/HA/MA生物墨水具有典型的剪切稀釋行為。它在低溫下具有很好的流動性，升溫至37℃后則能迅速交聯成水凝膠。通過對比HBC和 HBC/HA/MA的凝膠時間（彈性模量G '=損耗模量G "時的時間），發(fā)現同濃度的HBC與HBC/HA/MA生物墨水具有相似的凝膠時間，這說明HBC在HBC/HA/MA生物墨水的快速凝膠化中起主要作用。此外，HBC/HA/MA水凝膠的機械強度明顯高于HBC以及無化學鍵合的HBC/HA/MA水凝膠，且其機械強度在一定范圍內與HA濃度呈正比（圖2）。

2）溶脹率、穩(wěn)定性以及形態(tài)結構表征
研究人員用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察了HBC/HA/MA水凝膠的形態(tài)結構，發(fā)現水凝膠內部為尺寸較均勻(約100 μm)的高孔結構，而孔隙尺寸在一定范圍內會與HA濃度呈反比。他們還通過溶脹比分析以及體外降解試驗觀察了HBC/HA/MA水凝膠的溶脹率和降解行為。發(fā)現HBC/HA/MA水凝膠溶脹率低于HBC水凝膠，但其與細胞培養(yǎng)相關的平衡含水率未受顯著影響。此外，交聯度高的水凝膠穩(wěn)定性高，不易降解（圖2）。

圖2 HBC/HA/MA生物墨水的相關表征

2. 載NSCs的3D打印HBC/HA/MA支架的制備與相關檢測
研究者用含NSCs的HBC/HA/MA生物墨水制備了方形網格支架（打印過程中支架微觀結構未見變形或坍塌）并用Live/Dead assay評估了支架中NSCs的活力，發(fā)現其細胞活力與增殖能力較高。SEM結果也顯示，粘附在支架上的NSCs在培養(yǎng)7 d后充分延伸，形成了富含絲狀偽足的細胞間連接。他們還通過免疫熒光染色研究了生物打印后NSCs的分化能力：發(fā)現支架中的細胞表達星形膠質細胞標記物GFAP、神經元特異性細胞骨架蛋白Tuj1，并能成功分化為成熟神經元；他們還發(fā)現支架中HA的濃度對NSCs的神經元分化有重要影響，HBC/HA/MA-0.3支架中的NSCs具有較高的分化率（圖3）。

圖3 載NSCs的HBC/HA/MA支架的相關檢測

3. 3D打印的載NSCs的線性陣列樣支架用于SCI大鼠治療
1）運動功能評估
研究者打印了模擬天然脊髓白質結構的載NSCs線性陣列樣支架（后面統(tǒng)稱：載NSCs支架），然后將支架移植于T8-9脊髓完全橫斷的脊髓損傷模型大鼠的脊髓橫斷處。最后通過Basso-Beattie-Bresnahan (BBB)試驗以及柔性壓力傳感器實時監(jiān)測手段，對載NSCs支架（治療劑量：3×105）移植、空支架移植以及未治療組大鼠的后肢肌肉和關節(jié)的運動情況進行了評估。發(fā)現相較于后肢未見明顯運動的對照組大鼠。植入了載NSCs支架的大鼠的運動功能明顯恢復，且同時出現了臀部和膝蓋踝關節(jié)運動。載NSCs支架移植組修復SCI的效果優(yōu)于空支架移植組和對照組（圖4A-E）。

2）組織學分析
為了進一步研究載NSCs支架對SCI的治療效果，研究者對植入支架12周后的各組小鼠的損傷脊髓進行了組織學分析，通過免疫熒光染色檢測神經元、軸突以及少突膠質細胞的再生，并研究了脊髓損傷區(qū)神經纖維生長和髓鞘形成的情況。發(fā)現：載NSCs支架移植組病變區(qū)可見明顯Tuj1、NF、Oligo2、GAP-43、以及髓鞘堿性蛋白(MBP)的陽性染色，而GFPA表達則較低。這表明載NSCs支架促進了損傷部位軸突和髓鞘形成、神經元的分化并抑制了膠質瘢痕的形成（圖4F）。

3）植入后NSCs的存活及分化
研究者制備了載GFP-NSCs支架并將其植入病損區(qū)。然后在移植12周后取樣進行免疫熒光染色來監(jiān)測外源性NSCs在體內的命運。結果顯示隨支架移植的NSCs能存活至少12周，且GFP與大部分的Tuj1、NF、Oligo2定位一致，這提示存活的NSCs分化為了Tuj1陽性的神經元以及Oligo2陽性的少突膠質細胞。而未與GFP抗體共染的神經元和少突膠質細胞的存在則提示可能有內源性NSCs遷移至損傷區(qū)域參與損傷修復。這些結果均表明載NSCs的支架為NSCs提供了良好的微環(huán)境（圖4G-H）。

圖4 載NSCs支架移植促進SCI大鼠的脊髓損傷修復的相關評估

4. 總結
HBC/HA/MA水凝膠具有適合NSCs生長的降解速率、孔隙率和機械強度。利用HBC/HA/MA水凝膠制備的載NSCs支架為NSCs提供了良好的微環(huán)境，支架中的NSCs存活率高，增殖能力強，具有良好的神經分化能力。載NSCs支架移植后能促進脊髓損傷區(qū)的軸突和髓鞘形成，抑制膠質瘢痕形成，明顯改善SCI大鼠的運動功能。該3D生物打印的載NSCs支架有望應用于神經組織工程和其他再生醫(yī)學領域。

文章來源：
https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2021.120771