《Lab on a Chip》：具有 7 μm 孔隙的集成生物相容性 3D 打印等孔膜

來源： EngineeringForLife

等孔膜（具有平行、有序孔隙的膜）是許多機械和生物應用的理想選擇，如生物傳感、藥物檢測、藥物輸送、器官芯片技術、細胞分餾和其他生物分離。對多孔膜的廣泛興趣催生了許多制造技術，包括使用商業(yè)生產(chǎn)的膜、離子軌道蝕刻、水凝膠和其他立體光刻方法。此外，市售膜必須對齊、粘合或以其他方式整合到目標設備中，從而增加了制造時間和復雜性，并需要可能具有細胞毒性的額外材料。

來自美國楊百翰大學的Gregory P. Nordin團隊提出了一種新的3D打印技術，無需改進傳統(tǒng)3D打印機硬件，即可在3D打印部件的負特征中實現(xiàn)原生數(shù)字微鏡設備（DMD）分辨率，并演示了孔徑小至 7 μm 的完全集成、生物兼容的等孔膜的制造。利用這項技術構建了一個微流控裝置，該裝置模仿了已建立的器官芯片配置，包括一個集成的異孔膜。在膜的兩側播種了兩個細胞群，并對其進行成像，以此作為其他器官芯片應用的概念驗證。這些3D打印的等孔膜可用于多種其他機械和生物應用，為無縫集成的3D打印微流控設備創(chuàng)造了新的可能性。相關工作以題為“Integrated biocompatible 3D printed isoporous membranes with 7 μm pores”的文章發(fā)表在2024年3月14日的國際頂級期刊《Lab on a Chip》。

1. 創(chuàng)新型研究內容

本研究提出了一種新的3D打印方法來克服這些障礙。制作的多孔膜具有可控的孔徑和密度，并作為3D打印的一部分在原位制造。首先介紹了傳統(tǒng)3D打印技術可以實現(xiàn)的效果，然后開發(fā)了一種新的曝光方法，可以在3D打印部件中實現(xiàn)具有原生微鏡尺寸的空隙，從而產(chǎn)生具有 7 μm 孔隙的多孔膜。這種大小的孔適用于許多器官芯片應用，包括肺和胰腺模型等。然后將兩個熒光細胞群分別播種在膜的兩側，并用共聚焦熒光顯微鏡進行3D掃描，以顯示細胞粘附在膜上，但在膜的兩側仍保持物理上的不同，從而模仿了流行的器官芯片拓撲結構。

使用 OpenSCAD 時，會生成3D STL 模型，并使用自定義切片軟件進行切片，以生成用于單個曝光的圖像。圖 1 顯示了多孔膜幾何形狀的斜視圖以及用于曝光的單個圖像。打印完成后，用 2-丙醇清洗 3D 打印部件以去除未固化的 3D 打印樹脂，晾干，然后在定制固化站中使用 430 nm LED（Thorlabs，Newton，NJ，USA）進行 20 分鐘的后固化，固化平面的輻照度為 11.3 mW cm-2。

圖1 多孔膜的 3D CAD 設計

【傳統(tǒng) 3D 打印方法的評估】
傳統(tǒng)的3D打印通常僅限于創(chuàng)建具有相同厚度和曝光時間的層。本研究使用 10 微米厚的層和 100 到 300 毫秒不等的各種層曝光時間，評估了這種方法可實現(xiàn)的最小孔隙。圖 2（a-c）顯示了設計寬度為 5 像素或 38 微米的孔隙的結果。請注意，在曝光時間較短的情況下，孔隙要比設計的大得多（圖 2（a 和 b））。通常情況下，會增加曝光時間，嘗試縮小孔隙尺寸，直到與設計尺寸一致。如圖 2（c）所示，這種方法適用于小至 38 微米的孔隙。但對于更小的孔隙（圖 2(d-f)），孔隙在達到設計尺寸之前就會關閉并完全填滿，從而形成一層固體膜（圖 2(f)）。結果表明，使用這種傳統(tǒng)的3D打印方法，沒有任何設計和曝光設置組合能產(chǎn)生小于約 30 μm 的孔。

圖2 孔隙制造的傳統(tǒng) 3D 打印方法的局限性

【零厚度層】

本研究發(fā)現(xiàn)，在暴露時間很短的情況下，暴露區(qū)域不會完全聚合到設計的 10 μm 深度，從而導致膜與之前暴露的塊狀材料撕裂，造成類似圖 2（a）中所見的缺陷。為緩解這一問題，引入了制造零厚度層的想法。如圖 3(a) 所示，對于每一層，構建平臺都從凸起位置開始。如圖 3（b）所示，對于正常的 10 微米層，然后將其降低，直到 3D 打印部件的底部與樹脂托盤之間有 10 微米的間隙。然后激活紫外線源，形成厚度為 10 微米的新層，如圖 3（d）中紅色區(qū)域所示。最后，將構建平臺升起，使部件為下一層做好準備（圖 3(f)）。對于零厚度層，則將構建平臺降低，直到 3D 打印部件與樹脂托盤之間沒有間隙（圖 3（c））。隨后的紫外線曝光會使前一層進一步聚合（圖 3(e)），這樣就可以使用極短的曝光時間來制作具有極細細絲的薄膜。用于這種曝光的圖像應與現(xiàn)有的塊狀材料充分重疊，以確保新曝光層與現(xiàn)有部件之間有適當?shù)恼澈狭�，否則薄膜和細絲會被撕開。與正常情況類似，當構建平臺升起準備下一層時，這一層就完成了（圖 3(g)）。

圖3 零厚度層示意圖

本研究使用單層零厚度膜來制造孔徑從 38 微米（5 個圖像像素）到 7.6 微米（1 個圖像像素）的膜。典型結果如圖 4 所示。每一行代表不同的設計孔徑，每一列代表不同的曝光時間。最左側的一列代表 100 毫秒的曝光時間，顯示了非常稀疏的薄膜，薄膜上的細絲在打印過程中存活下來，并一直附著在塊狀材料上。如圖 4(m)所示，即使曝光時間很短，當孔徑為 7.6 微米時，孔也開始閉合。接下來增加曝光時間，試圖獲得更接近設計尺寸的更小孔隙。圖 4 中間一列顯示了中間曝光時間 150 毫秒的效果。對于設計尺寸大于 22 微米的膜，增加曝光時間確實有使孔變小的效果，但它們仍然比設計尺寸大得多（見圖 4（b、e 和 h））。此外，雖然 15.2 μm 的孔隙在 100 毫秒的曝光時間內是開放的（圖 4(j)），但現(xiàn)在已經(jīng)部分閉合，仍未達到設計尺寸（圖 4(k)）。7.6 μm 的孔已完全閉合（圖 4(n)）。圖 4 右欄顯示了較長的 200 毫秒曝光時間的效果。設計尺寸大于 30 微米的孔隙略有縮小，但仍未達到設計尺寸（圖 4（c 和 f））。設計尺寸為 22.8 μm 的開放孔隙同樣略有縮小，但已開始閉合（圖 4(i)）。設計尺寸小于 20 μm 的孔隙現(xiàn)已完全閉合（圖 4（l 和 o））。這些結果表明，可實現(xiàn)的最小孔隙尺寸仍然約為 30 μm，無論是增加曝光時間還是減小設計尺寸，都不會產(chǎn)生更小的孔隙。

圖4 單層零厚度孔隙制造的局限性

【重復零厚度層】

本研究發(fā)現(xiàn)，使用更多的零厚度層可以制造出更小的孔隙。首先，選擇一個通常會產(chǎn)生細絲網(wǎng)的曝光時間，然后利用該曝光時間重復制作零厚度層。第一層將膜的底部制作成細絲網(wǎng)格，隨后的各層則在細絲網(wǎng)格的基礎上加寬每根細絲，最終形成一個孔徑更小的漸寬網(wǎng)格。這里的關鍵似乎在于構建平臺的運動。本研究假設，在每次曝光之間，由于構建平臺的上下運動，3D 打印部件在液態(tài)樹脂中的運動會攪動樹脂，使部分聚合的樹脂遠離薄膜網(wǎng)格，從而在孔隙之間為后續(xù)層提供新鮮的樹脂池。然后，下一次曝光只在現(xiàn)有細絲附近完全聚合，使其變寬，而孔隙中的部分聚合樹脂則在下一次曝光前被移走。這個過程不斷重復，直到孔隙達到所需的尺寸。圖 5 顯示了實際應用中的情況，其中每個零厚度層的曝光時間為 100 毫秒。每一行代表一個設計孔徑，每一列代表不同數(shù)量的重復零厚度層。對于設計孔徑為 38 微米的膜，5 層零厚度膜仍會產(chǎn)生不規(guī)則孔徑的膜（圖 5(a)），但 30 層零厚度膜會產(chǎn)生均勻孔徑的膜（圖 5(c)）。設計孔徑為 22.8 μm 的膜表現(xiàn)類似，如圖 5（d-f）所示。設計尺寸為 7.6 微米（單個圖像像素）的最小孔隙則表現(xiàn)較差。在膜的某些區(qū)域，重復的零厚度層確實能將孔徑減小到 7 μm，但膜最終會畸形，尤其是靠近膜中心的部分（圖 5(g-i)）。

圖5 不同孔徑的重復零厚度層的效果

【增加支撐結構】
雖然可以實現(xiàn)小至 7 μm 的孔，但產(chǎn)生的孔網(wǎng)格可能非常不規(guī)則，特別是當需要具有高填充因子的小孔（<20 μm）時（注意圖 5（g-i）中膜中心區(qū)域的缺陷）。本研究認為這是由于薄膜在最初幾層開始形成時的機械不穩(wěn)定性造成的；薄絲在液態(tài)樹脂中移動時很容易被構建平臺的運動所移位。為了緩解這一問題，可以添加底層支撐柱。圖 6(a) 顯示了放置在薄膜下方的支撐柱（紅色）。圖 6(b) 顯示的是省略薄膜后的支柱外觀。請注意，在圖 6（c）中，支撐柱的寬度大于單個孔隙之間的空間，導致部分孔隙被堵塞。如圖 6(d)所示，支撐物提高了初始結構的穩(wěn)定性，并產(chǎn)生了 7 μm × 7 μm 的均勻孔隙，而且沒有已知的跨度限制。制作這些膜需要非常好的光學聚焦。一旦獲得了良好的聚焦，并確定了適當?shù)钠毓鈺r間和重復層數(shù)，就能以很高的成功率重復制作膜。膜一開始很薄，但隨著隨后的曝光會變厚。測得的薄膜平均厚度為 12.6 微米。如果需要更高的孔隙填充系數(shù)，也可以制作出具有 8 μm 孔隙的棋盤圖案，如圖 7 所示。該棋盤格圖案的制作采用了 300 毫秒的批量曝光時間和 25 層零厚度膜，膜的曝光時間為 100 毫秒。這種棋盤圖案的制作難度很大，目前只能制作出跨度約為 60 微米的圖案。

圖6 由 30 層零厚度膜和支撐柱組成的等孔膜

圖7 用 25 層零厚度膜制造的等孔膜，顯示出具有 8 微米孔隙的高填充因子棋盤圖案

【集成到器官芯片啟發(fā)裝置中】
使用類似圖 6（c）所示的膜，制作了一個完全3D打印的微流控裝置，并在膜腔上增加了頂蓋和通道，以便在膜的兩側播種細胞培養(yǎng)物。該裝置的 CAD 圖如圖 8（a） 和 （b）所示。按照上述方法對細胞進行播種和成像，得到的圖像如圖 8（c-f）所示。圖 8(c)顯示的是膜的顯微鏡圖像，其中底層支撐和孔都清晰可見。圖 8(d)和(e)為俯視圖和斜視圖，兩個細胞群均清晰可見。最后，圖 8(f)顯示的是側視圖，兩個細胞群都粘附在膜的表面，但在膜的兩側仍有物理上的區(qū)別，模擬了許多器官芯片應用中常見的拓撲結構。

圖8 膜設備的 CAD 圖紙和3D共聚焦熒光圖像，膜上有兩個細胞群種子

2. 總結與展望
傳統(tǒng)的 3D 打印工藝具有很大的局限性。本研究通過引入無需對3D打印機硬件本身進行任何修改即可創(chuàng)建更小空隙的功能，擴展了通用3D打印技術。具體來說，這項技術有助于在膜內精確放置空隙，從而創(chuàng)建出具有可控孔徑、定位和密度的等孔膜。這種方法加快并簡化了高度集成的微流控設備的生產(chǎn)，因為膜是用與設備其他部分相同的材料無縫制造的，不需要額外的材料或工藝。此外，這種技術與生物相容性樹脂兼容，因此對于涉及活細胞的應用（如器官芯片）來說非常寶貴。這項技術還有可能應用于其他3D打印機和樹脂，從而提高3D打印工藝的精度和多功能性，尤其適用于微流控技術。

文章來源：https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2024/lc/d4lc00014e