甲殼素納米原纖維輔助3D打印全甲殼素水凝膠用于傷口敷料

來源：EngineeringForLife

3D打印技術(shù)中使用的直接墨水書寫技術(shù)通常應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)水凝膠的設(shè)計(jì)。近期，武漢科技大學(xué)的段博團(tuán)隊(duì)提出了一種通過直接墨水書寫技術(shù)制備用于傷口敷料的全甲殼素墨水的策略（圖1）。打印的支架顯示出均勻的微米級(jí)孔隙結(jié)構(gòu)和納米纖維編織網(wǎng)絡(luò)。由于甲殼素和立體空間骨架具有良好的生物相容性，該支架作為傷口敷料表現(xiàn)出優(yōu)異的性能，可以促進(jìn)細(xì)胞增殖、膠原沉積和傷口的血管生成，顯示出其在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的潛力。

相關(guān)研究成果以“Chitin nanofibrils assisted 3D printing all-chitin hydrogels for wound dressing”為題于2024年3月6日發(fā)表在《Carbohydrate Polymers》上。

圖1 全甲殼素基3D打印油墨的設(shè)計(jì)

1. 3D打印甲殼素/MACNF油墨的表征
流變測(cè)試是表征直接油墨書寫（DIW）復(fù)合油墨性能的有效方法。首先研究了MACNF添加對(duì)甲殼素油墨的流變行為和可印刷性的影響。隨著剪切速率的增加，所有樣品的粘度都迅速降低，表明存在剪切稀化行為（圖2a）。圖2b顯示了儲(chǔ)能模量（G'）和損耗模量（G''）與振蕩應(yīng)力的函數(shù)關(guān)系。最終選擇5 wt%、7.5 wt%和10 wt% MACNF的引入量進(jìn)行3D打印。還測(cè)試了動(dòng)態(tài)階躍應(yīng)變掃描，模擬了整個(gè)3D打印過程（圖2c）。在1%和200%應(yīng)變下連續(xù)進(jìn)行3次掃描，分別模擬復(fù)合油墨的固態(tài)和流動(dòng)狀態(tài)，每個(gè)循環(huán)持續(xù)100 s。

圖2 15 °C下測(cè)試的甲殼素/MACNF油墨的流變行為

2. 3D打印甲殼素/MACNF支架的納米纖維結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能
選用甲殼素/5 wt% MACNF油墨作為例，所得支架保持了設(shè)計(jì)的形狀，而不會(huì)出現(xiàn)明顯的塌陷或變形（圖3a，b）。通過SEM仔細(xì)觀察支架的表面和橫截面（圖3c-f）。支架表面呈現(xiàn)出直徑均勻約330 μm的多糖細(xì)絲結(jié)構(gòu)，下層的細(xì)絲可以支撐上層細(xì)絲，從而承受重力。放大的照片顯示，支架的表面是一個(gè)均勻的納米纖維網(wǎng)絡(luò)，其中包括甲殼素納米纖維和MACNF（圖3g）。壓縮測(cè)試顯示MACNF的額外量對(duì)甲殼素水凝膠網(wǎng)絡(luò)有顯著影響，進(jìn)而影響其力學(xué)性能（圖3h-i）�？傊�，甲殼素/5 wt% MACNF支架在印刷操作和應(yīng)用中具有最佳的填料引入量和機(jī)械強(qiáng)度。

圖3 通過SEM和力學(xué)性能進(jìn)行形態(tài)觀察

3. 3D打印甲殼素/MACNF水凝膠中的相互作用
隨后，研究者采用XRD、FT-IR和XPS研究了3D打印甲殼素/MACNF支架水凝膠中再生甲殼素與β-甲殼素納米纖維之間的相互作用。XRD顯示了甲殼素/MACNF的聚集狀態(tài)（圖4a-b），特征峰變化表明MACNF的引入在一定程度上阻礙了甲殼素分子鏈的自組裝和甲殼素晶體的形成。FT-IR和XPS表明，具有親水性羧基和豐富含氧基團(tuán)的MACNF可以通過氫鍵與甲殼素分子鏈相互作用，從而調(diào)節(jié)甲殼素堿溶液的溶液性質(zhì)，使其復(fù)合油墨可印刷（圖4c-g）。

圖4 3D打印甲殼素/MACNF水凝膠中的相互作用

4. 細(xì)胞相容性和體內(nèi)傷口愈合
隨后，通過CCK-8和活死細(xì)胞染色評(píng)估了3D打印的全甲殼素基支架對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞（L929）的基本細(xì)胞毒性。如圖5所示，在與薄膜和支架組共培養(yǎng)1、2和3天后，L929細(xì)胞顯示出健康趨勢(shì)。從CCK8測(cè)定來看，細(xì)胞活性可以達(dá)到>90%，這證明甲殼素/5 wt% MACNF墨水對(duì)L929細(xì)胞幾乎無毒。

圖5 細(xì)胞相容性試驗(yàn)

為了進(jìn)一步評(píng)估薄膜和支架的效果，在全層皮膚缺損傷口模型中研究了促進(jìn)傷口愈合的能力。如圖6所示，隨著恢復(fù)時(shí)間的增加，小鼠的傷口逐漸閉合并減小。與對(duì)照組相比，薄膜和支架處理的傷口在3天后均有明顯的收縮，表明甲殼素水凝膠具有促進(jìn)傷口愈合的作用。HE染色結(jié)果（圖7）表明，在顯微鏡下，薄膜和支架組的未愈合區(qū)域小于紗布組，均在一定程度上促進(jìn)了傷口愈合。支架水凝膠更有效，這可能是由于微米級(jí)的孔隙結(jié)構(gòu)促進(jìn)了氧氣交換以及過量滲出物的蒸發(fā)，為傷口愈合提供了更合適的環(huán)境。Masson染色表明，甲殼素可以通過促進(jìn)傷口膠原沉積來加速傷口愈合，并且支架結(jié)構(gòu)比薄膜結(jié)構(gòu)具有更好的效果（圖8）。此外，使用CD31免疫組織化學(xué)染色對(duì)血管密度進(jìn)行進(jìn)一步定量，以顯示水凝膠在加速血管生成中的作用（圖9）。

圖6 傷口變化情況

圖7 傷口區(qū)域表皮再生傷口的HE染色圖像

圖8 Masson染色圖

圖9 CD31的免疫組織化學(xué)染色

綜上，本文成功構(gòu)建了一種高分辨率、高形狀保真度的全甲殼素基三維結(jié)構(gòu)。MACNF能夠作為增稠劑來調(diào)節(jié)油墨的流變特性。MACNF表面的親水性羧基和豐富的含氧基團(tuán)不僅能使其穩(wěn)定分散在甲殼素溶液中，而且能與甲殼素分子鏈形成大量的氫鍵相互作用，參與甲殼素的自組裝和聚集過程，從而賦予混合油墨印刷適性。三維多孔支架具有合適的機(jī)械強(qiáng)度，對(duì)細(xì)胞活性幾乎沒有影響。在傷口上應(yīng)用相同配方的流延膜和印刷支架時(shí)，甲殼素顯示出其優(yōu)異的生物相容性和生物活性，促進(jìn)細(xì)胞增殖、膠原沉積和血管生成，最后促進(jìn)傷口愈合。由于支架的微米級(jí)孔隙結(jié)構(gòu)，支架敷料下的傷口比薄膜敷料顯示出更快的愈合速度。

文章來源：https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2024.122028