生物打印水凝膠結(jié)構(gòu)中的3D功能神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)

供稿人：白路歌、王玲
供稿單位：西安交通大學(xué)機(jī)械制造系統(tǒng)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室　
來源：中國(guó)機(jī)械工程學(xué)會(huì)增材制造技術(shù)（3D打�。┓謺�(huì)

比起目前常用的2D神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)，3D神經(jīng)組織培養(yǎng)包含大量的物理和化學(xué)線索，為正常和病理情況下神經(jīng)元信號(hào)傳導(dǎo)和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)功能的相關(guān)研究提供了更有效的模型。已有大量研究使用生物打印方法制造體外3D神經(jīng)組織，但這些研究多使用模具輔助成形，缺乏適合神經(jīng)組織的通用生物墨水和生物打印方法，難以制造具有高度時(shí)空可控性的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

為了解決此問題，來自澳大利亞莫納什大學(xué)的Helena C. Parkington團(tuán)隊(duì)開發(fā)了低濃度明膠-降冰片烯聚(乙二醇)-二巰基生物墨水，使用大鼠初級(jí)皮層神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞，生物打印了包含灰質(zhì)和白質(zhì)在內(nèi)的類腦三維神經(jīng)結(jié)構(gòu)，并研究其網(wǎng)絡(luò)形成和功能。

如圖1所示，研究者使用含細(xì)胞生物墨水打印“細(xì)胞鏈”（綠色）模擬大腦灰質(zhì)，使用不含細(xì)胞墨水打印“脫細(xì)胞鏈”（灰色）模擬大腦白質(zhì)，交替打印“細(xì)胞鏈”和“非細(xì)胞鏈”模擬大腦層級(jí)結(jié)構(gòu)，并設(shè)計(jì)了兩種交替結(jié)構(gòu)A（圖1A）和B（圖1B）。培養(yǎng)7天之后，“細(xì)胞鏈”內(nèi)的神經(jīng)元胞體形成大的球形簇，類似于富含神經(jīng)元的大腦灰質(zhì)；“脫細(xì)胞鏈”內(nèi)不含胞體但含有大量神經(jīng)突，模擬了富含神經(jīng)突的大腦白質(zhì)；各“細(xì)胞鏈”之間通過建立跨“脫細(xì)胞鏈”的突觸連接形成了廣泛的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，“細(xì)胞鏈”之間軸突的生長(zhǎng)模式似乎受到“細(xì)胞鏈”和“脫細(xì)胞鏈”的接近程度和相對(duì)排列的影響。在結(jié)構(gòu)A中神經(jīng)突選擇了阻力較小的路徑，即優(yōu)先沿“脫細(xì)胞鏈”表面生長(zhǎng)，在結(jié)構(gòu)B中神經(jīng)突選擇了最短路徑，即穿過中間的“脫細(xì)胞鏈”區(qū)域進(jìn)行連接。

圖1生物打印皮層結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)及培養(yǎng)7天后的免疫熒光染色圖像。（標(biāo)尺：100 μm）

研究者通過鈣成像和電信號(hào)記錄進(jìn)一步探索了打印得到的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的功能。細(xì)胞鈣成像顯示在體外培養(yǎng)14天（圖2A, C）和21天（圖2B, D）之后，神經(jīng)組織出現(xiàn)有節(jié)律、準(zhǔn)同步的自發(fā)鈣振蕩。電信號(hào)結(jié)果表明（圖3），當(dāng)一個(gè)“細(xì)胞鏈”的神經(jīng)元受到電刺激時(shí)，遠(yuǎn)處另一“細(xì)胞鏈”的神經(jīng)元產(chǎn)生相應(yīng)的電活動(dòng)。這些結(jié)果表明，所構(gòu)建的體外神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的神經(jīng)元群之間形成了跨越“脫細(xì)胞鏈”空間的功能連接。

圖2 體外培養(yǎng)14天和21天之后細(xì)胞鈣成像結(jié)果

圖3 體外培養(yǎng)12 后電刺激下“細(xì)胞鏈”間功能電生理。（標(biāo)尺：200 μm）

綜上所述，這項(xiàng)研究報(bào)告了一種生物打印方法，可以高分辨率和高通量地制造具備復(fù)雜結(jié)構(gòu)的軟性獨(dú)立神經(jīng)結(jié)構(gòu)，且形成了自發(fā)的、刺激響應(yīng)的、功能性的3D神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)，探討了生物打印如何影響神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的形成和神經(jīng)元的功能，為理解神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的基本問題、工程神經(jīng)形態(tài)電路和體外藥物篩選提供了潛在平臺(tái)。

參考文獻(xiàn)：
Yao Y, Coleman H A, Meagher L, et al. 3D Functional Neuronal Networks in Free‐Standing Bioprinted Hydrogel Constructs[J]. Advanced Healthcare Materials, 2023: 2300801.