《Biofabrication》：利用明膠和脫細(xì)胞骨顆粒組成的生物墨水進(jìn)行細(xì)胞打印

來源： EngineeringForLife

生物制造應(yīng)用面臨的主要挑戰(zhàn)之一是如何獲得能在可打印性、形狀保真度、細(xì)胞活力和組織成熟度之間取得平衡的生物墨水。脫細(xì)胞方法可以提取天然細(xì)胞外基質(zhì)，保留組織特異性基質(zhì)蛋白。然而，骨骼脫細(xì)胞的關(guān)鍵挑戰(zhàn)在于如何保留有機(jī)成分（膠原蛋白、蛋白聚糖）和無機(jī)成分（羥基磷灰石），以保持骨骼的天然成分和功能。此外，有必要研究脫細(xì)胞骨（DB）顆粒作為一種基于組織的添加劑在生物墨水配方中的作用，以開發(fā)功能性生物墨水。

來自土耳其伊茲密爾理工學(xué)院的Aylin Kara Özenler 團(tuán)隊(duì)與來自德國埃爾朗根-紐倫堡大學(xué)的Aldo R Boccaccini團(tuán)隊(duì)評(píng)估了在含有明膠（GEL）和前成骨細(xì)胞（MC3T3-E1）或人間充質(zhì)干細(xì)胞（hTERT-MSCs）的生物墨水配方中加入不同大�。ā�45 和 ≤100 μm）和濃度（1%、5%、10%（重量百分比））的脫細(xì)胞骨顆粒的效果。此外，本研究還提出了一種使用明膠、DB 顆粒和細(xì)胞的簡(jiǎn)易生物墨水配方，其制備過程簡(jiǎn)單，細(xì)胞存活率高。本研究對(duì)油墨的打印性能進(jìn)行了評(píng)估。此外，還通過剪切稀化和觸變性測(cè)試確定了流變特性。生物打印結(jié)構(gòu)經(jīng)過 28 天的培養(yǎng)。使用生化分析和熒光顯微鏡評(píng)估了細(xì)胞的活力、增殖和成骨分化能力。DB 顆粒的加入增強(qiáng)了細(xì)胞增殖和成骨分化能力，這可能是由于 DB 顆粒含有天然膠原蛋白和羥基磷灰石。使用 DB 粒子后，堿性磷酸酶活性顯著增加，特別是在沒有誘導(dǎo)細(xì)胞成骨的情況下。此外，熒光圖像顯示了細(xì)胞與材料之間明顯的相互作用以及細(xì)胞在結(jié)構(gòu)內(nèi)部的附著。有了這些充滿希望的結(jié)果，目前的簡(jiǎn)易生物墨水配方被認(rèn)為是骨組織工程的潛在候選材料，它是一種可用于臨床的材料，制備簡(jiǎn)單，細(xì)胞活性高。相關(guān)工作以題為“3D bioprinting of mouse pre-osteoblasts and human MSCs using bioinks consisting of gelatin and decellularized bone particles”的文章發(fā)表在2024年03月13日的國際知名期刊《Biofabrication》。

1. 創(chuàng)新型研究?jī)?nèi)容

本研究的目的是開發(fā)一種由凝膠、DB 顆粒和細(xì)胞組成的最小化生物墨水配方，并評(píng)估凝膠基質(zhì)中不同大小和濃度的 DB 顆粒對(duì)細(xì)胞行為的影響。研究示意圖如圖 1 所示。在之前的研究中，發(fā)現(xiàn) DB 粒子和 GEL 組合作為生物材料墨水對(duì) MC3T3-E1 前成骨細(xì)胞有利。本研究用小鼠前成骨細(xì)胞（MC3T3-E1）和人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞（hTERT-MSCs）測(cè)試了 GEL/DB 復(fù)合生物墨水配方。在凝膠基質(zhì)中加入了不同大小和濃度的 DB 粒子，以獲得可打印的配方，同時(shí)增強(qiáng)細(xì)胞的行為。正如本研究之前所報(bào)道的，100 微米的顆粒大小會(huì)降低較高顆粒濃度下的可打印性，因此，本研究的假設(shè)是，減小顆粒大小可能會(huì)增加可打印性，而且細(xì)胞行為也會(huì)隨著 DB 顆粒濃度的增加而增加。因此，本研究在兩種不同細(xì)胞類型的生物墨水配方中評(píng)估了不同大小的 DB 粒子的效果。通過與 mTG 交聯(lián)，3D生物打印結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性得以保持。在為期 28 天的培養(yǎng)過程中，對(duì)所有3D生物打印細(xì)胞負(fù)載 GEL/DB 構(gòu)建物的細(xì)胞相容性、生物活性和成骨分化進(jìn)行了評(píng)估。

圖1 研究示意圖

【流變特性】

本研究對(duì) GEL 和 DB 嵌入式 GEL 生物材料油墨的流變特性進(jìn)行了評(píng)估，以模擬與打印工藝相關(guān)的油墨流動(dòng)條件。每組都進(jìn)行了剪切稀化試驗(yàn)，通過將剪切速率從 0 s-1 增加到 100 s-1 來測(cè)量粘度。圖 2A 顯示，所有生物材料油墨的粘度都隨著剪切速率的增加而降低，這表明所有材料都表現(xiàn)出適合擠壓式 3D 打印的剪切稀化行為。在剪切速率為 10 s-1 時(shí)，GEL 的粘度被測(cè)定為 74 Pa.s，與加入 DB 粒子的組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖 2（B））。此外，添加不同大小和濃度的 DB 粒子也會(huì)影響粘度。經(jīng)測(cè)定，GEL/1 DB（100 μm）、GEL/5 DB（100 μm）、GEL/5 DB（45 μm）和 GEL/10%DB （45 μm）的粘度分別為 91.70、111.61、123.84 和 170.67 Pa.s，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上存在顯著差異（圖 2(B)）。與 100 μm 的 DB 顆粒相比，45 μm 的 DB 顆粒增加了油墨的粘度，其統(tǒng)計(jì)差異表明較小的顆粒尺寸增強(qiáng)了流變特性。值得注意的是，如圖 2（B）所示，摻入 10% DB 顆粒的油墨粘度更高。這可能是由于油墨內(nèi)部顆粒之間的相互作用。當(dāng)復(fù)合油墨配方中的固體顆粒之間的相互作用被剪切力破壞時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)剪切變稀的行為。油墨靜止時(shí)的粘度較高，這是由懸浮顆粒之間的相互作用重新組織決定的，從而提供了形狀穩(wěn)定性。因此，較小尺寸的 DB 顆粒濃度越高，懸浮顆粒之間的相互作用就越密集，從而導(dǎo)致粘度越高。此外，在本研究團(tuán)隊(duì)之前的研究中，本研究發(fā)現(xiàn)較高的 DB 粒子濃度（>5%）會(huì)降低可打印性，而另一方面，高濃度的 DB 粒子有助于細(xì)胞生長(zhǎng)。本研究發(fā)現(xiàn)較小尺寸的 DB 粒子在較高濃度下會(huì)增強(qiáng)流變特性，這也是本研究的假設(shè)之一。

圖2 油墨和 3D 打印水凝膠的流變特性及打印性能評(píng)估

【3D 打印 GEL/DB 支架】
本研究對(duì) GEL 和 GEL/DB 油墨的可打印性進(jìn)行了評(píng)估。光鏡圖像顯示了用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶交聯(lián)后不同大小和濃度的3D打印 GEL 和 GEL/DB 水凝膠（圖 2(D)）。水凝膠被制成圓柱形，具有交替的 0°/90°支桿結(jié)構(gòu)，從而在支桿之間形成方形大孔。3D打印的 GEL 和 GEL/DB 水凝膠顯示出具有方形孔幾何形狀的良好打印結(jié)構(gòu)（圖 2(D)）。所有墨水都很容易打印，特別是較小尺寸（45 微米）、較高濃度的 DB 粒子有利于打印，這可能是均勻分布在 GEL 基質(zhì)中的懸浮較小 DB 粒子之間相互作用的結(jié)果。盡管純 GEL 水凝膠具有透明度，但顆粒濃度越高，GEL/DB 水凝膠的濁度越高（圖 2(D)）。所有組的打印適性因子（Pr）都是通過公式（1）計(jì)算得出的。Pr < 1 表示油墨凝膠不足，孔角呈圓形；Pr = 1 表示凝膠適當(dāng)，孔幾何形狀呈理想的方形；而 Pr > 1 則表示油墨過度凝膠。所有組的 Pr 因子都接近 1。含有 5%DB 的 GEL 組顯示出較低 Pr 因子（Pr = 0.9 ± 0.04）的圓形孔幾何形狀，與純 GEL 水凝膠相比，本研究發(fā)現(xiàn)了統(tǒng)計(jì)差異（圖 2（E））。根據(jù)之前的報(bào)道，當(dāng) Pr 因子在 0.9 和 1.1 之間時(shí)，3D打印水凝膠會(huì)顯示出適當(dāng)?shù)墓尚螒B(tài)。因此，5% 的 DB 粒子（100 微米大�。�會(huì)降低3D打印性能，而 5%的 DB 粒子（45 微米大�。﹦t顯示出最佳打印性能。此外，5% 的 DB 粒子（粒徑為 45 微米）的 Pr 系數(shù)為 0.9，具有足夠的打印能力和形狀保真度。與純 GEL 組相比，將顆粒尺寸減小到 45 微米可提高 5% DB 組的可打印性，但在統(tǒng)計(jì)上沒有差異。

【生物打印的 MC3T3-E1 前成骨細(xì)胞負(fù)載 GEL/DB 構(gòu)建物】
本研究成功制作了負(fù)載 1% GEL/DB 構(gòu)建物的 MC3T3-E1 前成骨細(xì)胞，并在細(xì)胞培養(yǎng)期間用光學(xué)顯微鏡觀察了細(xì)胞在構(gòu)建物內(nèi)的分布和定位情況。圖 3 顯示了 GEL 和 GEL/DB 結(jié)構(gòu)以及 TCP（組織培養(yǎng)聚苯乙烯）對(duì)照組內(nèi)部的細(xì)胞光鏡圖像。在生物打印之前，制備了含有 MC3T3-E1 的2D鑄造 GEL 和 GEL/DB 水凝膠，以觀察水凝膠中的細(xì)胞。由于 GEL 水凝膠是完全透明的，因此不易分辨水凝膠的邊緣。如圖 3(A)所示，GEL 和 GEL/DB 水凝膠中的細(xì)胞都是可見的，7 d 后可觀察到附著和伸長(zhǎng)的細(xì)胞（圖 3(A)）。此外，還觀察到細(xì)胞附著在 GEL/DB 水凝膠中的 DB 顆粒上（圖 3（A））。在3D生物打印樣品中，MC3T3-E1 細(xì)胞分布在 GEL 和 GEL/1% DB 構(gòu)建物中，并且在細(xì)胞培養(yǎng)期間不斷增殖（圖 3(B)）。此外，如圖 3（C）中的放大圖片所示，14 天后，細(xì)胞遷移到結(jié)構(gòu)表面，并完全覆蓋了3D生物打印結(jié)構(gòu)。GEL水凝膠在 14 天后會(huì)降解，并開始在細(xì)胞培養(yǎng)基中失重，這在之前的報(bào)道中已有提及。由于 GEL 開始降解，細(xì)胞可以在 3D 打印的結(jié)構(gòu)中找到空間并在結(jié)構(gòu)中遷移。在培養(yǎng)期間，隨著結(jié)構(gòu)的降解和細(xì)胞的增殖，細(xì)胞遷移到結(jié)構(gòu)外，并在細(xì)胞培養(yǎng)板上觀察到細(xì)胞，如放大圖像所示（圖 3(C)）。此外，GEL 的特定 RGD 序列允許細(xì)胞在整個(gè)培養(yǎng)期間粘附和增殖，這證明了 GEL 和 GEL/DB 生物墨水配方的細(xì)胞相容性。

圖3 充滿細(xì)胞的2D鑄模和3D生物打印結(jié)構(gòu)的光學(xué)顯微鏡圖像

在3D生物制造結(jié)構(gòu)中，保持細(xì)胞活力和3D打印結(jié)構(gòu)的形狀保真度或穩(wěn)定性是一個(gè)重要的關(guān)鍵因素。因此，在培養(yǎng)期間對(duì)3D生物打印結(jié)構(gòu)中的 MC3T3-E1 細(xì)胞進(jìn)行活/死染色后，對(duì)其存活率進(jìn)行了觀察。熒光顯微鏡圖像顯示了活細(xì)胞（綠色）、死細(xì)胞（紅色）和細(xì)胞核（藍(lán)色）（圖 4）。DB 顆粒也因其自發(fā)熒光而顯示為藍(lán)色/綠色。圖像顯示，MC3T3-E1 細(xì)胞在第 7 天時(shí)附著在 GEL 和 GEL/DB 構(gòu)建物內(nèi)并保持活力（圖 4(A)）。14 天后，細(xì)胞在結(jié)構(gòu)中附著和擴(kuò)散得更多，只觀察到少量死細(xì)胞（圖 4(A)）。培養(yǎng) 14 d 后，DAPI 染色顯示細(xì)胞核密集。此外，2D細(xì)胞負(fù)載 GEL 和 GEL/DB 水凝膠中的 MC3T3-E1 細(xì)胞在第 14 天仍保持活力（圖 4(B)）�；�/死染色結(jié)果證實(shí)，GEL 和 GEL/DB 墨水配方具有細(xì)胞相容性，不會(huì)損害 MC3T3-E1 細(xì)胞的活力。

圖4 MC3T3-E1 細(xì)胞的活/死染色結(jié)果

在 28 天的培養(yǎng)期內(nèi)，用 LDH 細(xì)胞毒性檢測(cè)法評(píng)估了油墨可能產(chǎn)生的細(xì)胞毒性效應(yīng)。在2D細(xì)胞培養(yǎng)中，細(xì)胞釋放的細(xì)胞外 LDH 水平相似，在 28 天的培養(yǎng)期內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)差異（圖 5(A)）。然而，3D生物打印組在第 1 天的 LDH 水平明顯更高（圖 5(A)）。早期 LDH 水平較高的原因可能是3D生物打印過程中剪切力導(dǎo)致細(xì)胞死亡。在隨后的培養(yǎng)天數(shù)中，細(xì)胞外 LDH 水平持續(xù)下降，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這表明剩余細(xì)胞在后期培養(yǎng)中存活并增殖。MC3T3-E1 細(xì)胞的存活率是根據(jù) WST-8 法測(cè)定的細(xì)胞代謝活性進(jìn)行量化的，數(shù)據(jù)顯示，在整個(gè)培養(yǎng)過程中，各組細(xì)胞的存活率都在逐漸增加（圖5(B)）。此外，3D生物打印 GEL 和 GEL/DB 結(jié)構(gòu)的細(xì)胞存活率較高，與2D澆鑄組相比有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。此外，與其他組相比，3D生物打印 GEL/DB 結(jié)構(gòu)中的細(xì)胞存活率最高（圖 5(B)）。

【細(xì)胞增殖和形態(tài)】
根據(jù) PicoGreen 檢測(cè)法對(duì)dsDNA 的定量分析，本研究評(píng)估了生物打印結(jié)構(gòu)內(nèi)部的細(xì)胞增殖情況。與根據(jù)代謝活性得出的存活率結(jié)果（圖 5(B)）一致，生物打印結(jié)構(gòu)內(nèi)部的細(xì)胞數(shù)量在細(xì)胞培養(yǎng)期間逐漸增加（圖 5(C)）。第一天，生物打印結(jié)構(gòu)中的細(xì)胞數(shù)量低于2D澆注水凝膠中的細(xì)胞數(shù)量，這可能是圖 5（A）所示第一天釋放的 LDH 較高的結(jié)果。第一天之后，2D澆注水凝膠組的細(xì)胞數(shù)量在第 7 天有所增加，然后在整個(gè)培養(yǎng)期間保持穩(wěn)定。另一方面，3D生物打印結(jié)構(gòu)中的細(xì)胞在 28 天內(nèi)繼續(xù)增殖，與2D水凝膠相比，在第 7 天、14 天和 28 天發(fā)現(xiàn)了顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。此外，在第 21 天，生物打印 GEL/DB 構(gòu)建物中的細(xì)胞數(shù)量最多，與3D打印 GEL 組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖 5(C)）。根據(jù)細(xì)胞毒性、存活率和增殖調(diào)查，GEL 和 DB 加入 GEL 的生物墨水為生物打印后的細(xì)胞生長(zhǎng)提供了3D微環(huán)境，作為一種基于天然的最小化生物墨水配方，顯示出良好的效果。

本研究利用熒光顯微鏡評(píng)估了3D生物打印結(jié)構(gòu)和2D澆注水凝膠內(nèi)的細(xì)胞粘附性和細(xì)胞形態(tài)。DAPI 和 F-Actin 染色分別顯示 MC3T3-E1 細(xì)胞的細(xì)胞核（藍(lán)色）和細(xì)胞骨架（綠色）。顯微鏡圖像顯示了2D鑄造和3D生物打印結(jié)構(gòu)的細(xì)胞粘附情況，以及培養(yǎng) 28 天后細(xì)胞與材料的相互作用（圖 5(D)）。2D澆鑄組在第 28 天顯示了細(xì)胞與材料的相互作用，細(xì)胞覆蓋了 DB 嵌入 GEL 水凝膠內(nèi)的 DB 顆粒表面（圖 5(D)）。在3D生物打印 GEL/DB 組中，細(xì)胞覆蓋了結(jié)構(gòu)，顯示出與 DB 粒子非常積極的相互作用，此外，細(xì)胞在第 28 天覆蓋了孔區(qū)域，這可以從放大圖像中看到（圖 5(D)）。

圖5 細(xì)胞在 GEL 和 GEL/DB 構(gòu)建物內(nèi)生長(zhǎng)

【評(píng)估不同大小和濃度的 DB 粒子對(duì)負(fù)載 hTERT-間充質(zhì)干細(xì)胞的3D生物打印 GEL/DB 構(gòu)建物的細(xì)胞行為的影響】

本研究對(duì)3D生物打印結(jié)構(gòu)內(nèi)的細(xì)胞存活率通過活/死染色進(jìn)行了評(píng)估。熒光顯微鏡圖像顯示，在 28 天的培養(yǎng)期間，細(xì)胞在 GEL 和 GEL/DB 構(gòu)建物內(nèi)存活和生長(zhǎng)（圖 6）。此外，由于膠原纖維的自發(fā)熒光，DB 顆粒顯示出藍(lán)色。第一天，在所有組中都觀察到大量存活細(xì)胞（綠色），并檢測(cè)到細(xì)胞集群，特別是在 DB 結(jié)合的結(jié)構(gòu)中。由于顆粒密度高且具有自發(fā)熒光，hTERT-間充質(zhì)干細(xì)胞在第一天并不清晰可見。然而，大面積的綠色染色，尤其是在 10%的 DB 組中，表明結(jié)構(gòu)內(nèi)形成了細(xì)胞簇（圖 6）。7 天后，細(xì)胞開始在生物打印結(jié)構(gòu)中伸長(zhǎng)和擴(kuò)散，之后細(xì)胞在 28 天的培養(yǎng)期內(nèi)保持活力并不斷增殖。hTERT 間充質(zhì)干細(xì)胞的擴(kuò)散良好，培養(yǎng) 28 d 后觀察到細(xì)胞完全覆蓋。此外，活細(xì)胞的密度在所有培養(yǎng)日都很高。即使在第 28 天也很難發(fā)現(xiàn)死細(xì)胞（紅色），這表明油墨配方具有細(xì)胞相容性，較高的 DB 粒子濃度有助于細(xì)胞生長(zhǎng)。

圖6 3D生物打印 GEL 和 GEL/DB 復(fù)合結(jié)構(gòu)中 hTERT-MSC 細(xì)胞第 14 天的活/死染色結(jié)果

生物打印后，使用 LDH 細(xì)胞毒性檢測(cè)法對(duì)墨水材料的潛在細(xì)胞毒性進(jìn)行量化。將含有細(xì)胞的結(jié)構(gòu)培養(yǎng) 28 天，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的細(xì)胞外 LDH 釋放量進(jìn)行量化。結(jié)果顯示，在整個(gè)培養(yǎng)過程中，各組的 LDH 水平都保持穩(wěn)定，沒有增加。各時(shí)間點(diǎn)和各組之間沒有發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這表明含有 GEL 成分的 DB 對(duì) hTERT-間充質(zhì)干細(xì)胞沒有細(xì)胞毒性作用（圖 7(A)）。正如在 GEL 構(gòu)建物中加入兔 DB 粒子（圖 4 和圖 5）所顯示的那樣，牛 DB 粒子對(duì) hTERT-MSC 也沒有細(xì)胞毒性作用。

圖7 生物打印 GEL/DB 構(gòu)建物內(nèi) hTERT-MSC 細(xì)胞的生物活性

本研究利用共聚焦顯微鏡詳細(xì)評(píng)估了3D生物打印結(jié)構(gòu)內(nèi)部的細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞附著情況。細(xì)胞核（藍(lán)色）和細(xì)胞骨架（綠色）分別采用 DAPI 和 F-Actin 染色（圖 8）。此外，由于 DB 顆粒中纖維膠原的自發(fā)熒光，結(jié)構(gòu)內(nèi)部的 DB 顆粒也清晰可見（呈紅色/粉紅色）。圖像顯示，細(xì)胞在第 28 天時(shí)在3D生物打印結(jié)構(gòu)內(nèi)部生長(zhǎng)和增殖（圖 8）。細(xì)胞在 GEL 和 GEL/DB 構(gòu)建物內(nèi)附著并伸長(zhǎng)，所有組中都能看到細(xì)胞覆蓋的趨勢(shì)。值得注意的是，在含有 10% DB 的 GEL 構(gòu)建物中觀察到了更大的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)以及與 DB 顆粒的良好互動(dòng)。這種細(xì)胞粘附性表明，細(xì)胞與 GEL/DB 組中均勻分布的 DB 顆粒進(jìn)行了理想的相互作用。

圖8 3D生物打印 GEL 和 GEL/DB 構(gòu)建物內(nèi)生長(zhǎng)的 hTERT 間充質(zhì)干細(xì)胞在培養(yǎng)第 28 天時(shí)的共聚焦顯微鏡圖像

2. 總結(jié)與展望
本研究展示了一種由 GEL、DB 顆粒和 MC3T3-E1 前成骨細(xì)胞或 hTERT-MSCs組成的最小化生物墨水配方。本研究的主要方法是利用骨組織的天然 ECM 成分，并確定顆粒的理想濃度，以獲得更好的細(xì)胞反應(yīng)。本研究中使用的 DB 顆粒不僅含有膠原纖維，還含有羥基磷灰石，而現(xiàn)有研究同時(shí)使用了脫細(xì)胞和脫礦物質(zhì)過程，這導(dǎo)致骨的生物礦化特性被削弱。此外，本研究還提出了基于 GEL 的 mTG 交聯(lián)（一種已獲 FDA 批準(zhǔn)的材料）簡(jiǎn)約生物墨水配方，與使用多種改性劑或化學(xué)成分的復(fù)雜水凝膠系統(tǒng)相比，這種配方可以直接制備，而這些改性劑或化學(xué)成分可能會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒性，也無法用于臨床。

文章來源：https://iopscience.iop.org/article/10.1088/1758-5090/ad2c98