體外多孔肝癌模型的3D生物打�。航�立、評(píng)價(jià)和抗癌藥物測(cè)試

來源：生物設(shè)計(jì)與制造

傳統(tǒng)的腫瘤模型往往不能準(zhǔn)確地模擬體外腫瘤生長(zhǎng)或?qū)崿F(xiàn)個(gè)性化治療，特別是無法發(fā)現(xiàn)更有益的靶向藥物。為了解決這個(gè)問題，本研究描述了利用三維(3D)生物打印技術(shù)，通過將甲基丙烯酸明膠(GelMA)和聚環(huán)氧乙烷(PEO)作為兩種不混溶的材料作為生物墨水，并創(chuàng)新地應(yīng)用熒光碳量子點(diǎn)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行長(zhǎng)期跟蹤，構(gòu)建了人肝癌SMMC-7721細(xì)胞體外腫瘤模型(3DP- 7721)。體積比為3:1的GelMA(10%，質(zhì)量分?jǐn)?shù))和PEO(1.6%，質(zhì)量分?jǐn)?shù))水凝膠具有明顯的成孔特性，令人滿意的力學(xué)性能和生物相容性，可用于創(chuàng)建3DP -7721模型。采用免疫熒光法和定量實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)評(píng)價(jià)模型的生物學(xué)特性。與二維培養(yǎng)細(xì)胞模型(2D-7721)和三維混合培養(yǎng)細(xì)胞模型(3DM-7721)相比，3DP -7721模型顯著提高了細(xì)胞的增殖能力以及腫瘤相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)。此外，我們?cè)u(píng)估了三種培養(yǎng)模型之間的差異以及三種模型中抗腫瘤藥物的有效性，發(fā)現(xiàn)三種模型之間的抗腫瘤藥物的有效性存在差異，這是因?yàn)槿�種模型之間的耐藥蛋白和基因存在顯著差異。此外，比較三種模型的成瘤情況發(fā)現(xiàn)，3DP -7721模型培養(yǎng)的細(xì)胞對(duì)裸鼠具有較強(qiáng)的致瘤性。免疫組化評(píng)價(jià)實(shí)體瘤形成相關(guān)生化指標(biāo)水平顯示，3DP -7721模型組表現(xiàn)出惡性腫瘤病理特征，生成的實(shí)體瘤與實(shí)際腫瘤相似，惡化程度更高。本研究為3DP -7721模型在藥物開發(fā)研究中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

圖1 實(shí)驗(yàn)過程及檢測(cè)流程圖。(a) 生物墨水組成、3D打印工藝和結(jié)構(gòu)交聯(lián)示意圖；(b) 建立2D-7721、3DM-7721和3DP -7721模型進(jìn)行耐藥評(píng)價(jià)的比較。SMMC-7721：人肝癌細(xì)胞；3D：三維；2D-7721：二維培養(yǎng)模型；3DM-7721：3D混合培養(yǎng)模型；3DP -7721：3D生物打印模型；GelMA：甲基丙烯酸明膠;PEO:聚環(huán)氧乙烷；CDs：碳量子點(diǎn)

圖2 GelMA體積比 (10%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)) 與PEO體積比 (1.6%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)) 對(duì)孔隙大小有不同的影響。(a-e) 不同GelMA與PEO體積比下羅丹明b染色多孔水凝膠結(jié)構(gòu)的熒光顯微圖和(f-i) 粒徑分布直方圖。GelMA：甲基丙烯酸明膠；PEO：聚環(huán)氧乙烷

圖3 多孔水凝膠結(jié)構(gòu)的 (a) 應(yīng)力-應(yīng)變曲線和 (b) 楊氏模量。不同體積比下GelMA和PEO的溶脹率和孔隙率。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，n=3.*p<0.05， **p<0.01， **p<0.001。GelMA：甲基丙烯酸明膠；PEO：聚環(huán)氧乙烷

圖4 打印參數(shù)優(yōu)化。不同打印速度和壓力(1 bar = 100 kpa)下的打印全景圖。比例尺：3 mm, n=5

圖5 3D生物打印肝癌細(xì)胞模型中肝臟相關(guān)蛋白的表達(dá)。圖中為3DP -7721模型打印7 d后AFP、Ki67、CYP3A4、ALB的表達(dá)情況。比例尺:300 μm。n = 3。3D：三維；ALB：白蛋白；AFP：甲胎蛋白；Ki67：增殖標(biāo)記蛋白Ki-67；CYP3A4：細(xì)胞色素p450氧化酶家族成員；3DP -7721：3D生物打印模型；DAPI：4,6 -二氨基-2-苯基吲哚；CDs：碳量子點(diǎn)

圖6 生物3D打印肝癌細(xì)胞模型中mRNA的表達(dá)。第1、5、10、15天2D-7721、3DM-7721和3DP -7721模型中腫瘤相關(guān)蛋白和基因的mRNA表達(dá)，包括(a) AFP、(b) TGF-β、(c) EpCAM、(d) CD133、(e) IL-8和 (f) CD24。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，n=3。0.05， **p<0.01， **p<0.001。3D：三維；2D-7721：二維培養(yǎng)模型；3DM-7721：3D混合培養(yǎng)模型；3DP -7721：3D生物打印模型；AFP：甲胎蛋白；TGF- β：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子；EpCAM：上皮細(xì)胞粘附分子；CD133：prominin-1；IL-8：白介素-8；CD24：分化簇24

圖7 (a) 3DP -7721模型中SMMC-7721細(xì)胞與不同濃度DOX孵育24 h的熒光成像。比標(biāo)條:300 μm。(b) DOX、(c) 木犀草素、(d) 順鉑在2D-7721、3DM-7721、3DP -7721模型治療48 h后的劑量效應(yīng)曲線。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，n=4。SMMC-7721：人肝癌；CDs：碳量子點(diǎn)；DOX：鹽酸阿霉素；2D-7721：二維培養(yǎng)模型；3DM-7721：三維混合培養(yǎng)模型；3DP -7721：3D生物打印模型；IC50：最大抑制濃度的一半

圖8 2D- 7721、3DM-7721和3DP -7721模型耐藥蛋白和耐藥基因mRNA表達(dá)情況。(a) MRP1, (b) BCRP, (c) MDR-1, (d) MRP2, (e) ABCB1, (f) EGFR mRNA表達(dá)。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，n=3。*P<0.05， **p<0.01， **p<0.001。2D-7721：二維培養(yǎng)模型；3DM-7721：三維混合培養(yǎng)模型；3DP-7721：3D生物打印模型；MRP1：多藥耐藥相關(guān)蛋白1；BCRP：乳腺癌耐藥蛋白；MDR-1：多藥耐藥1；MRP2：多藥耐藥相關(guān)蛋白2；ABCB1：atp結(jié)合盒亞家族b成員1基因；EGFR:表皮生長(zhǎng)因子受體

圖9 不同模型細(xì)胞的致瘤性。裸鼠 (b) 腫瘤(2D-7721、3DM-7721和3DP -7721培養(yǎng)組)形成腫瘤后21天的照片。(c) 第21天腫瘤重量。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，n=3。*p<0.05。(d) 不同模型各時(shí)間點(diǎn)小鼠體重和 (e) 腫瘤體積。(f) 不同模型實(shí)體瘤HE、Ki67、EpCAM、CD133、TUNEL染色結(jié)果。2D-7721：二維培養(yǎng)模型；3DM-7721：三維混合培養(yǎng)模型；3DP -7721：3D生物打印模型；HE：蘇木精和伊紅；Ki67：增殖標(biāo)記蛋白Ki-67；EpCAM：上皮細(xì)胞粘附分子；CD133：prominin-1；TUNEL：末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移介導(dǎo)dutp -生物素缺口末端標(biāo)記試驗(yàn)