華西口腔郭維華IJB：利用擠出式3D打印構建HERS-DPCs/GelMA支架促進牙槽骨再生

來源： EFL生物3D打印與生物制造

赫特維希上皮根鞘（HERS），是牙發(fā)育過程中內(nèi)釉上皮和外釉上皮向根尖方向生長形成的雙層上皮結構，HERS內(nèi)側是牙乳頭細胞（DPCs），在牙根發(fā)育過程中，HERS可誘導DPCs分化為成牙本質(zhì)細胞，后者參與根部牙本質(zhì)的形成。然而，HERS僅在牙根發(fā)育的特定時期短暫出現(xiàn)，原代HERS細胞數(shù)量少、不易獲取，常規(guī)的二維培養(yǎng)環(huán)境容易使其上皮特性丟失，從而失去誘導間充質(zhì)細胞分化的功能。如何維持HERS的上皮特性，充分發(fā)揮上皮間充質(zhì)間的相互作用，是牙及其支持組織再生研究的一個難點。

最近，四川大學華西口腔醫(yī)院的郭維華教授團隊基于擠出式3D生物打印技術利用GelMA水凝膠重組SD大鼠來源的HERS細胞和DPCs，并通過體內(nèi)實驗來驗證HERS-DPCs/GelMA支架的成骨能力。相關論文“3D-bioprinted Recombination Structure of Hertwig’s Epithelial Root Sheath Cells and Dental Papilla Cells for Alveolar Bone Regeneration”發(fā)表在International Journal of Bioprinting雜志上，第一作者為唐慧琳碩士，通訊作者為郭維華教授。

該研究的總體思路是根據(jù)牙發(fā)育過程中HERS和DPCs的空間位置關系設計“層狀結構”模型，以GelMA水凝膠為支架材料，通過擠出式3D打印技術構建HERS-DPCs/GelMA結構，并將支架植入SD大鼠的牙槽窩缺損，驗證該支架產(chǎn)生礦化組織、促進牙槽骨缺損修復的能力，為牙相關組織工程和上皮-間充質(zhì)相互作用研究提供新思路。

首先，研究人員從SD大鼠乳鼠牙胚中獲取HERS細胞和DPCs，光鏡下觀察到HERS細胞成團生長，形狀如鋪路石，DPCs則呈長梭形。免疫熒光染色結果顯示：上皮細胞標志物CK14和間充質(zhì)細胞標志物Vimentin在HERS細胞中均呈陽性表達，提示HERS細胞已發(fā)生上皮間充質(zhì)轉化，同時具有上皮和間充質(zhì)細胞的特性（圖1，A）。

然后，用10% w/v的GelMA溶液分別重懸HERS細胞和DPCs，獲得細胞密度約為1×106/ml的生物墨水用于3D打印。該研究利用擠出式3D打印機的兩個打印頭，可實現(xiàn)兩種生物墨水的組合式打印，如先打印一層HERS細胞，接著打印兩層DPCs，制備HERS-DPCs立體層狀結構，同樣大小含單一細胞的立體結構作為對照�；�/死細胞染色實驗的結果顯示，在培養(yǎng)后的第1、4和7天，GelMA支架中活細胞比例均在80%以上，證明GelMA有優(yōu)異的生物相容性，適宜細胞的生長（圖1，B和C）。

圖1 HERS細胞的分離、培養(yǎng)、鑒定和活力

為了進一步探究HERS-DPCs/GelMA支架中兩種細胞的相互作用，研究人員利用熒光染料DiO和DiL分別將DPCs和HERS細胞標記為綠色和紅色，并在共聚焦顯微鏡下于三維打印后的第0、3和8天進行觀察，結果發(fā)現(xiàn)，第8天時，兩種細胞發(fā)生遷移，二者的界限也變得模糊（圖2）。

圖2 體外HERS-DPC相互作用

光鏡和掃描電鏡的結果表明，3D打印的立體層狀結構呈網(wǎng)格狀，孔隙均勻，直徑約為0.8 mm。從培養(yǎng)后的第3天開始，細胞從GelMA支架中爬出，并大量增殖，第4天時的細胞匯合度高達80%，表明此時的細胞生長狀態(tài)良好。隨后，研究人員通過SD大鼠的牙槽窩移植實驗評估HERS-DPCs/GelMA支架的骨再生效果。該實驗分為5個組，分別為空白組、HERS細胞（3D）組、DPCs（3D）組、HERS-DPCs（3D）組和HERS-DPCs混合組，空白組不植入任何材料，HERS-DPCs混合組是將兩種細胞直接與GelMA水凝膠混合，不進行3D打印。選取8周齡的雌性SD大鼠，拔除右上頜第一、第二磨牙，然后用牙科種植機預備牙槽窩，將樣本植入后嚴密縫合（圖3）。

圖3 打印結構的顯微觀察及牙槽窩移植

觀察8周后取材進一步分析。HE、Masson染色結果顯示各組手術區(qū)域均有新形成的膠原纖維，空白組的纖維相對更少、更薄。免疫組化染色結果表明：DPCs（3D）組和HERS-DPCs（3D）組的成骨相關標志物（COL-I、OCN、RUNX-2）均有陽性表達，且HERS-DPCs（3D）組有明顯的新骨生成（圖4）。

圖4  8周后通過HE染色、Masson染色及免疫組化染色評價牙槽骨種植情況

該研究基于擠出式3D生物打印利用GelMA重組HERS細胞和DPCs，并通過牙槽窩移植實驗驗證重組結構的成骨性能。研究結果表明GelMA具有優(yōu)異的生物相容性，有利于細胞增殖、遷移等活動。3D打印的方式最大程度地模擬體內(nèi)牙發(fā)育過程中的微環(huán)境，構建的HERS-DPCs共培養(yǎng)結構中，HERS細胞和DPCs發(fā)生遷移，植入SD大鼠牙槽窩缺損后有利于牙槽骨再生。該研究為牙源性上皮-間充質(zhì)相互作用的研究提供了新策略。

文章來源：
http://doi.org/10.18063/ijb.v8i3.512