哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院《Science》子刊：利用3D打印治療鈣化主動(dòng)脈瓣病

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鈣化主動(dòng)脈瓣�。–AVD）是一種活躍、細(xì)胞驅(qū)動(dòng)、進(jìn)行性疾病，其特征是瓣膜纖維化增厚，隨后發(fā)生葉瓣鈣化、瓣膜狹窄，最終導(dǎo)致心力衰竭和死亡。部分原因是由于缺乏適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛠?lái)幫助我們建立藥物干預(yù)發(fā)展的分子基礎(chǔ)，目前沒(méi)有有效的藥物可供使用。主動(dòng)脈瓣（AV）葉片由其細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）組成的三個(gè)不同層次定義：富含膠原的纖維層、富含蛋白多糖的海綿層和富含彈性蛋白的心室層。瓣膜間質(zhì)細(xì)胞（VICs）是AV中最常見(jiàn)的細(xì)胞類型。在生理?xiàng)l件下，VICs是靜止的類成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，并通過(guò)增殖和組織重塑維持瓣膜的穩(wěn)態(tài)。然而，在病理?xiàng)l件下，這些VICs變得活化，并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞或促鈣化的成骨細(xì)胞樣細(xì)胞，在ECM中積極沉積羥基磷灰石。嵌入在更硬的纖維層中的VICs推動(dòng)鈣化擴(kuò)散到海綿層，而相對(duì)不受影響的是心室層。因此，能夠在易患疾病的纖維層等環(huán)境中研究VICs的能力對(duì)于增加對(duì)CAVD病理學(xué)的理解至關(guān)重要。在CAVD中，感受力敏感的瓣膜細(xì)胞對(duì)纖維化和鈣化引起的組織硬化做出反應(yīng)，進(jìn)一步推動(dòng)病理生理過(guò)程。由于缺乏（i）能夠重現(xiàn)這種復(fù)雜環(huán)境的適當(dāng)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ鸵约埃╥i）對(duì)新型工程主動(dòng)脈瓣（AV）模型性能進(jìn)行基準(zhǔn)測(cè)試，目前沒(méi)有藥物治療CAVD的藥物。

來(lái)自美國(guó)哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Elena Aikawa團(tuán)隊(duì)建立了一種基于生物材料的CAVD模型，模擬了人類易患纖維層的生物力學(xué)特性，并將其3D生物打印到96孔板中。通過(guò)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析細(xì)胞蛋白質(zhì)組和囊泡組，比較了3D生物打印模型與傳統(tǒng)的2D單細(xì)胞培養(yǎng)模型與人類CAVD組織之間的差異。3D生物打印模型高度重現(xiàn)了CAVD細(xì)胞蛋白質(zhì)組（與2D蛋白質(zhì)的70%相比，達(dá)到94%）。將細(xì)胞和囊泡數(shù)據(jù)集整合起來(lái)，識(shí)別出與AV鈣化普遍相關(guān)的已知和未知蛋白質(zhì)。本研究探討了2D和3D生物工程系統(tǒng)如何重現(xiàn)人類疾病的獨(dú)特方面，將多組學(xué)作為一種評(píng)估高通量生物工程模型系統(tǒng)的技術(shù)，并為未來(lái)的藥物發(fā)現(xiàn)提供了潛力。相關(guān)工作以題為“Intracellular proteomics and extracellular vesiculomics as a metric of disease recapitulation in 3D-bioprinted aortic valve arrays”的文章發(fā)表在2024年2月28日的國(guó)際頂級(jí)期刊《Science Advances》。

1. 創(chuàng)新型研究?jī)?nèi)容
本研究利用細(xì)胞和EV蛋白質(zhì)組學(xué)，通過(guò)評(píng)估作為靜態(tài)生物力學(xué)特性的函數(shù)發(fā)生的細(xì)胞和EV蛋白質(zhì)組水平的變化，全面而整體地表征體外模型對(duì)該疾病的重現(xiàn)。此外，本研究還開(kāi)發(fā)、驗(yàn)證并對(duì)CAVD發(fā)病機(jī)制的3D生物工程模型系統(tǒng)進(jìn)行基準(zhǔn)測(cè)試，這些模型系統(tǒng)與高通量藥物篩選平臺(tái)兼容。

【高通量生物打印平臺(tái)創(chuàng)建了一系列具有生物力學(xué)相關(guān)性的CAVD模型數(shù)組】
本研究采用甲基丙烯酰化明膠和透明質(zhì)酸（GelMA/HAMA）構(gòu)建了一個(gè)水凝膠系統(tǒng)，其中攜帶有初代人類VICs，并根據(jù)AV特定的（和疾病驅(qū)動(dòng)的）生物力學(xué)進(jìn)行調(diào)節(jié)（圖1A和B）。使用的VICs來(lái)自人類CAVD組織樣本。生物打印參數(shù)經(jīng)過(guò)優(yōu)化，以適應(yīng)適用于高通量篩選的96孔板陣列，顯示出孔井之間的一致性（圖1B和C）。VICs對(duì)ECM的硬度有感知和響應(yīng)能力；因此，對(duì)于成功的CAVD模型來(lái)說(shuō)，材料硬度的重現(xiàn)必不可少，與原生主動(dòng)脈瓣層次相一致。通過(guò)調(diào)節(jié)紫外（UV）固化時(shí)間，操控了水凝膠的機(jī)械特性，并在96孔板陣列格式中復(fù)制了海綿質(zhì)（受疾病保護(hù)）和纖維質(zhì)（易患疾病）瓣膜層的力學(xué)特性，基于先前的研究并通過(guò)納米壓痕分析進(jìn)行了確認(rèn)（圖1D和E）。納米壓痕測(cè)量的熱圖顯示了水凝膠表面上的空間分辨率一致性的生物力學(xué)測(cè)量結(jié)果（圖1D），并通過(guò)定量分析重現(xiàn)了已知的層特異性生物力學(xué)特性（圖1E）。由于鈣化主要發(fā)生在主動(dòng)脈瓣的纖維質(zhì)層，因此后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中使用了類纖維層的水凝膠模型。

圖1 主動(dòng)脈瓣模型的3D生物打印

通過(guò)展示在96孔板生物打印水凝膠陣列中廣泛調(diào)節(jié)生物力學(xué)特性的能力，使其覆蓋一系列（病理）生物學(xué)相關(guān)的硬度范圍，隨后的實(shí)驗(yàn)專注于與疾病相關(guān)的類纖維層水凝膠，重現(xiàn)了易患疾病的主動(dòng)脈瓣區(qū)域的生物力學(xué)特性。先前的研究已經(jīng)顯示，培養(yǎng)14天后，VIC封裝的水凝膠模型在不同培養(yǎng)條件下的鈣化情況存在顯著差異，借此指導(dǎo)了本研究的培養(yǎng)時(shí)間表。在正常培養(yǎng)基（NM）或兩種刺激鈣化的培養(yǎng)基：有機(jī)磷酸鹽成骨培養(yǎng)基（OM）或無(wú)機(jī)磷酸鹽促鈣化培養(yǎng)基（PM）中培養(yǎng)14天后，類纖維層水凝膠中的VIC在所有培養(yǎng)基類型和重復(fù)實(shí)驗(yàn)中維持了較高的存活率（圖2A，頂部和B，左側(cè)）。瓣膜鈣化可以是不同過(guò)程的產(chǎn)物，例如類骨母細(xì)胞樣VIC的活性礦物沉積，或與細(xì)胞凋亡相關(guān)的鈣化，后者通常被認(rèn)為是體外培養(yǎng)的人工過(guò)程。末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的脫氧尿苷三磷酸核苷酸末端標(biāo)記（TUNEL）染色顯示，在所有水凝膠和培養(yǎng)條件中，幾乎沒(méi)有與細(xì)胞凋亡相關(guān)的細(xì)胞死亡，證實(shí)鈣化很可能不是由細(xì)胞死亡相關(guān)的鈣積累介導(dǎo)的（圖2A，底部和B，右側(cè)）。通過(guò)使用近紅外鈣示蹤劑（Osteosense680）對(duì)類纖維層96孔水凝膠陣列中的鈣化進(jìn)行了評(píng)估。所有的3D陣列培養(yǎng)基條件都顯示了一定程度的Osteosense680陽(yáng)性染色（圖2C）。然而，在OM和PM條件下，微小鈣化灶數(shù)量（圖2D）和信號(hào)強(qiáng)度（圖2E）均呈上升趨勢(shì)，并且在統(tǒng)計(jì)上存在顯著增加。

圖2 在有機(jī)磷酸鹽和無(wú)機(jī)磷酸鹽培養(yǎng)基條件下，培養(yǎng)在類纖維層水凝膠中的VICs保持存活，并誘導(dǎo)鈣化

【細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定了在3D生物打印陣列中建模的獨(dú)特病理過(guò)程】

一旦細(xì)胞存活和鈣化誘導(dǎo)得到確認(rèn)，本研究使用基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)方法評(píng)估了3D生物打印的VIC水凝膠CAVD陣列條件下與傳統(tǒng)的2D VIC單細(xì)胞培養(yǎng)條件下分別對(duì)原生CAVD組織表型的重現(xiàn)能力（CAVD）（圖3A）。在3D和2D條件下，鑒定出了超過(guò)2500種蛋白質(zhì)，兩種體外模型之間的鑒定蛋白質(zhì)的重疊率超過(guò)99%（圖3B）。為了去除培養(yǎng)準(zhǔn)備過(guò)程中可能產(chǎn)生的潛在背景污染物，本研究還探究了僅含細(xì)胞外水凝膠的蛋白質(zhì)組，并對(duì)其與Hathewaya histolytica（膠原酶來(lái)源）、豬（GelMA/HAMA來(lái)源）、牛（培養(yǎng)血清來(lái)源）和人類（用于識(shí)別目標(biāo)蛋白質(zhì)組同源性）蛋白質(zhì)組進(jìn)行了比對(duì)（圖3B）。隨后的分析中包括了CAVD組織來(lái)源的細(xì)胞（圖3C）。未經(jīng)過(guò)濾的主成分分析（PCA）顯示了按模型類型（圖2D）和鈣化培養(yǎng)基處理（圖3E，僅體外）進(jìn)行的三種蛋白質(zhì)組的無(wú)偏聚類。在2D和3D體外模型之間，測(cè)得的蛋白質(zhì)組中有48%的差異豐度，而CAVD與2D或3D之間的差異豐度不到30%。這表明體外模型的細(xì)胞蛋白質(zhì)組之間的差異比它們與新鮮組織的細(xì)胞蛋白質(zhì)組之間的差異更大（圖3F）。接下來(lái)，本研究確定了表征2D和3D條件之間以及體外模型與組織之間關(guān)鍵差異的基因本體論（GO）術(shù)語(yǔ)（圖3，G'和G"），2D培養(yǎng)中的蛋白質(zhì)與血小板聚集、同型細(xì)胞間粘附、典型糖酵解和肌動(dòng)蛋白絲解聚相關(guān)，而3D培養(yǎng)中的蛋白質(zhì)與膠原纖維排列、蛋白質(zhì)N-和O-糖基化、COPI包被小泡運(yùn)輸以及線粒體組織相關(guān)。最后，分離的CAVD細(xì)胞中富集了與調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、補(bǔ)體激活和糖脂轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的蛋白質(zhì)（圖3G），與原生CAVD中存在的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)一致。

圖3 CAVD水凝膠模型的細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)揭示了模擬病理過(guò)程的轉(zhuǎn)化靶點(diǎn)

本研究的目標(biāo)是將體外培養(yǎng)的細(xì)胞蛋白質(zhì)豐度與CAVD來(lái)源的細(xì)胞蛋白質(zhì)豐度進(jìn)行相關(guān)性分析。成對(duì)相關(guān)性分析顯示，所有體外培養(yǎng)基條件之間相關(guān)性都很高（r > 0.9）。全面的蛋白質(zhì)組相關(guān)性分析顯示，2D和3D細(xì)胞與CAVD細(xì)胞之間存在顯著相關(guān)性（2D ravg = 0.82；3D ravg = 0.79）。接下來(lái)，將2D和3D蛋白質(zhì)豐度與所有培養(yǎng)基條件下的AV數(shù)據(jù)集進(jìn)行比較（圖4B和C）。在2D模型中，與原生CAVD相比，NM是具有最多的差異蛋白質(zhì)，而PM是具有最少的差異蛋白質(zhì)（圖4B）；與之不同的是，3D陣列中的細(xì)胞蛋白質(zhì)中很少有與CAVD有差異豐度的蛋白質(zhì)（圖4C）。總體而言，3D模型在94%的測(cè)量蛋白質(zhì)中重現(xiàn)了CAVD細(xì)胞蛋白質(zhì)豐度的特征，而2D模型則重現(xiàn)了70%的蛋白質(zhì)豐度。這表明3D模型可能在整體上最適合識(shí)別在疾病誘導(dǎo)過(guò)程中蛋白質(zhì)豐度變化，這種變化最接近于在原生組織中觀察到的變化。

接下來(lái)，本研究使用蛋白質(zhì)趨勢(shì)分析來(lái)確定在2D和3D條件下，哪些關(guān)鍵蛋白質(zhì)最能重現(xiàn)CAVD細(xì)胞蛋白質(zhì)組（圖4D至H）。在2D PM條件下，重現(xiàn)CAVD豐度的蛋白質(zhì)與細(xì)胞粘附（CDH13和ARHGDIB）和細(xì)胞骨架組織（PACSIN2、CNN2和THY1）相關(guān)（圖4D至F）。在3D條件下，OM和PM培養(yǎng)基都重現(xiàn)了與超分子纖維組織（MFAP4、COL18A1和TMOD1）、脂蛋白代謝（APOA1和APOE）、負(fù)調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞增殖（SCG2、PDCD10）和脂肪酸β-氧化（ATFA和ECHS1）相關(guān)的CAVD蛋白質(zhì)豐度（圖4G至I）。本研究還發(fā)現(xiàn)了一組在所有3D培養(yǎng)基條件下與CAVD組織趨勢(shì)一致的蛋白質(zhì)（圖4G，底部）。這種以細(xì)胞蛋白質(zhì)組為中心的分析無(wú)偏地顯示，3D水凝膠陣列重現(xiàn)了在2D單細(xì)胞培養(yǎng)中無(wú)法捕捉到的疾病的獨(dú)特方面。

圖4 3D生物打印模型的細(xì)胞蛋白質(zhì)組能夠最好地重現(xiàn)在鈣化條件下的CAVD細(xì)胞病理學(xué)

【EV載體蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)CAVD病理中的差異負(fù)載】
有證據(jù)表明，EV在動(dòng)脈粥樣硬化和CAVD（鈣化性心血管疾�。┲邪l(fā)揮著基礎(chǔ)性作用。為了評(píng)估EV在體外CAVD建模中的作用，本研究進(jìn)行了EV載體蛋白質(zhì)組學(xué)分析。本研究分離了EV并通過(guò)納米粒子追蹤分析確定了適當(dāng)?shù)拇笮》秶�。�?duì)分離的EV進(jìn)行的蛋白質(zhì)組學(xué)分析鑒定出了1300多種蛋白質(zhì)，其中包括26種常見(jiàn)的EV標(biāo)記物（圖5A）。主成分分析顯示了模型和培養(yǎng)基標(biāo)記的EV蛋白質(zhì)組之間的明顯聚類（圖5B和C）。與細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析不同，所有培養(yǎng)基條件（NM、OM、PM）在體外模型之間產(chǎn)生了類似數(shù)量的差異EV載體蛋白質(zhì)（圖5E）。然而，總體上EV蛋白質(zhì)組更加穩(wěn)定：在任何體外模型的任何培養(yǎng)基處理中，只有平均5%（977個(gè)蛋白質(zhì)中的42個(gè)）的總蛋白質(zhì)豐度存在差異（圖5E），而在NM條件下細(xì)胞蛋白質(zhì)組中有15%存在差異（圖3H）。在2D和3D模型中，所有差異的EV載體蛋白質(zhì)中，僅有不到4%在不同培養(yǎng)基處理之間共享，這表明每種培養(yǎng)基和模型都具有獨(dú)特的負(fù)載響應(yīng)（圖5F至H）。在2D NM模型中，與EV載體的關(guān)鍵差異與整合素介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)（CD63、FLNA、FERMT2和FERMT3）以及線粒體膜相關(guān)的凋亡（YWHA家族）有關(guān)（圖5F）。OM EV載體差異與超氧化物調(diào)節(jié)（PRDX2、APOA4和SOD2）以及細(xì)胞外基質(zhì)組裝（TNXB、PXDN、LAMB1和EMILIN1）有關(guān)（圖5G）。最后，PM EV載體的變化與纖溶酶原（ENO1和THBS1）以及細(xì)胞外基質(zhì)（VIM、MFAP4和EMILIN1）有關(guān)（圖5H）。

圖5 EV蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定了基質(zhì)依賴的物質(zhì)加載和普遍存在的與主動(dòng)脈瓣相關(guān)的物質(zhì)

【多層次組學(xué)數(shù)據(jù)集的整合顯示了CAVD重現(xiàn)的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素】

在深入描述細(xì)胞和EV蛋白質(zhì)組中的差異豐度模式后，本研究的目標(biāo)是研究這些蛋白質(zhì)組之間的關(guān)聯(lián)模式，以確定在不同刺激條件下3D打印水凝膠模型和2D培養(yǎng)條件中重現(xiàn)CAVD病理的蛋白質(zhì)。為此，本研究利用了兩種計(jì)算分析方法：正則化典型相關(guān)分析（rCCA）（圖6）和用于單個(gè)樣本的線性插值網(wǎng)絡(luò)估計(jì)（LIONESS）（圖7），每種方法闡明了不同的關(guān)聯(lián)方面。首先，本研究旨在檢查細(xì)胞和EV數(shù)據(jù)集中的哪些蛋白質(zhì)推動(dòng)了體外鈣化模型和原發(fā)性CAVD組織的重現(xiàn)。本研究使用rCCA來(lái)識(shí)別正交分量或變量之間的最大相關(guān)性（圖6A至D）。典型分量1顯示了2D和3D體外模型之間的高相關(guān)性，而典型分量2顯示了3D模型和CAVD組織之間的高相關(guān)性（圖6A）。相關(guān)圓圈圖用于可視化典型分量之間的關(guān)系，其中每個(gè)點(diǎn)代表細(xì)胞或EV蛋白質(zhì)組中的一個(gè)蛋白質(zhì)（圖6B）。通過(guò)對(duì)這些數(shù)據(jù)進(jìn)行閾值處理，本研究確定與每個(gè)典型分量顯著相關(guān)的蛋白質(zhì)（圖6B和C）。本研究觀察到了具有相同類型相關(guān)性的變量（蛋白質(zhì)）的子集簇（圖6C）。與之相對(duì)應(yīng)的相關(guān)網(wǎng)絡(luò)顯示了推動(dòng)鈣化水凝膠和CAVD組織之間相關(guān)性的細(xì)胞和EV載體蛋白質(zhì)（圖6D）。本研究發(fā)現(xiàn)，雖然EV蛋白質(zhì)占兩個(gè)數(shù)據(jù)集的比例不到10%，但它們占據(jù)了推動(dòng)CAVD和體外模型中鈣化的蛋白質(zhì)的30%以上。在被確定為與CAVD組織重現(xiàn)鈣化模型的98%的蛋白質(zhì)（65個(gè)中的64個(gè)，P < 0.05，根據(jù)精確二項(xiàng)檢驗(yàn)）之前已被認(rèn)為與心血管疾病有關(guān)（PheGenI，美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心）。這些綜合的多層次蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法確定了鈣化的已知和未知驅(qū)動(dòng)因素，并確定了這種3D水凝膠模型在體外重現(xiàn)CAVD疾病方面的改進(jìn)。

圖6 通過(guò)整合細(xì)胞和EV載體衍生的蛋白質(zhì)組，對(duì)鈣化模型中疾病重現(xiàn)的網(wǎng)絡(luò)分析進(jìn)行了研究

最后，本研究旨在利用多組學(xué)整合和系統(tǒng)生物學(xué)方法，確定在這些模型中與鈣化有關(guān)的已知和未知蛋白質(zhì)。圖7中顯示的網(wǎng)絡(luò)是由三種類型的節(jié)點(diǎn)構(gòu)成的頂部加載信息：比較鈣化模型（案例和圓角正方形）、細(xì)胞和EV層的兩個(gè)主要成分（鉆石）以及這些主要成分的加載蛋白質(zhì)（圓圈；黃色代表細(xì)胞，粉色代表EV）（圖6A）。根據(jù)它們?cè)谀Ｐ椭械墓蚕沓潭�，進(jìn)一步對(duì)蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)進(jìn)行分類，網(wǎng)絡(luò)從最共享到最特定進(jìn)行組織排列（圖7的第4到第1層）。在60多個(gè)細(xì)胞和EV來(lái)源的蛋白質(zhì)中，至少與另一個(gè)條件共享（圖7的第2到第4層），突出顯示了獨(dú)立于維度或磷酸鹽類型的驅(qū)動(dòng)CAVD模型中鈣化的蛋白質(zhì)。在這個(gè)綜合分析中，僅有四種蛋白質(zhì)被確認(rèn)為細(xì)胞和EV蛋白質(zhì)組之間的共享驅(qū)動(dòng)因子，它們是維納蛋白（VTN）、乳糖粘附蛋白（MFGE8）、聚類素（CLU）和鈣蛋白L1H（S100A9）。在無(wú)偏子簇中，共享生物過(guò)程的蛋白質(zhì)被分組（圖7）。在三個(gè)條件之間共享的細(xì)胞和EV蛋白質(zhì)中，突出的過(guò)程包括線粒體代謝（MAOB和MDH1）、細(xì)胞-基質(zhì)粘附（THBS1、SOD3和NID2）以及肌動(dòng)蛋白絲結(jié)合（VIM、MSN、CFL2、SYNE3、TPM4和TMSB4X）。僅有19%（215個(gè)中的41個(gè)，P < 0.05，根據(jù)精確二項(xiàng)檢驗(yàn)）的蛋白質(zhì)被確認(rèn)為先前與瓣膜疾病有關(guān)（PheGenI，NCBI）。這個(gè)綜合分析突顯了體外鈣化的已知和未知驅(qū)動(dòng)因素。

圖7 將細(xì)胞和EV載體衍生的蛋白質(zhì)組進(jìn)行多組學(xué)整合，對(duì)鈣化過(guò)程中已知和未知的蛋白質(zhì)進(jìn)行差異豐度排名

圖8顯示了每個(gè)體外模型中最好重現(xiàn)疾病的生物途徑的圖形摘要。本研究發(fā)現(xiàn)3D水凝膠模型能夠重現(xiàn)人類CAVD組織的ECM蛋白質(zhì)組、細(xì)胞-ECM相互作用和線粒體代謝調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)譜。然而，無(wú)論是2D還是3D模型，在免疫/炎癥反應(yīng)方面都缺乏組織中發(fā)現(xiàn)的響應(yīng)。雖然在瓣膜鈣化的背景下，免疫共培養(yǎng)研究有限，但最近的單細(xì)胞研究表明細(xì)胞間的跨類型細(xì)胞間通信在鈣化性瓣膜疾病中的重要性。本研究提出的模型為進(jìn)一步增加復(fù)雜性提供了基礎(chǔ)，例如共培養(yǎng)其他細(xì)胞類型、（病理）生理性周期性剪切/拉伸和額外的層特異性生物力學(xué)。雖然我們的研究主要關(guān)注纖維層和海綿層的特性，但富含彈性蛋白和受疾病保護(hù)的心室內(nèi)膜在培養(yǎng)條件下已被證明在體內(nèi)驅(qū)動(dòng)獨(dú)特的蛋白質(zhì)特征，并且很可能主要對(duì)應(yīng)于拉伸而不是壓縮應(yīng)力的瓣膜生理響應(yīng)。

圖8 總結(jié)每個(gè)模型在細(xì)胞和EV方面對(duì)CAVD組織重現(xiàn)的GO術(shù)語(yǔ)

2. 總結(jié)與展望
本研究注意到在NM條件下出現(xiàn)了輕度的自發(fā)性鈣化，這可能是由于在生物打印過(guò)程中暴露于剪切應(yīng)力和高達(dá)75 bar的壓力，這兩者都已被證明可以誘導(dǎo)肌成纖維細(xì)胞的活化。此外，本實(shí)驗(yàn)中使用的VICs來(lái)自患有疾病的人類瓣膜，可能包含了本研究團(tuán)隊(duì)之前證明的成骨肌成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞的一群細(xì)胞。盡管如此，與NM對(duì)照組相比，在3D培養(yǎng)中，在鈣化培養(yǎng)基處理?xiàng)l件下，本研究在細(xì)胞和EV載體中發(fā)現(xiàn)了顯著的蛋白質(zhì)組學(xué)變化，證明了該模型的可行性。本研究利用基于自下而上的蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定的肽段的種屬特異性，對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）和其他潛在污染物進(jìn)行了背景蛋白質(zhì)組的整理。在未來(lái)的研究中，本研究將致力于使用針對(duì)ECM的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，來(lái)識(shí)別對(duì)膠原亞型、翻譯后修飾和細(xì)胞-基質(zhì)相互作用的機(jī)械響應(yīng)。這些技術(shù)還可用于評(píng)估細(xì)胞和EV對(duì)水凝膠中使用的不同基質(zhì)微環(huán)境的反應(yīng)。這種EV分析還可以擴(kuò)展到識(shí)別驅(qū)動(dòng)EV與微囊泡分泌及其相應(yīng)蛋白質(zhì)組的因素。

文章來(lái)源：
https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adj9793