生物3D打印進展綜述：從打印方法到生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用

來源：EFL生物3D打印與生物制造

在過去的幾十年中，生物3D打印已被廣泛地應(yīng)用于構(gòu)建如皮膚、血管、心臟等諸多組織/器官原型，，這不僅為器官替換的宏偉目標(biāo)奠定基礎(chǔ)，也可作為體外病理模型服務(wù)于藥物篩選、器官發(fā)育及病變等領(lǐng)域�？紤]到器官/組織有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，種類繁多的生物3D打印方法被開發(fā)出來用以針對不同的應(yīng)用場景。如何根據(jù)應(yīng)用需求來選擇合適的生物打印方法？本綜述中我們系統(tǒng)地回顧了生物3D打印的發(fā)展、工藝流程和分類，重點介紹了打印的基本原理和商業(yè)化的生物打印設(shè)備；對擠出式、液滴式和光固化式生物3D打印進行了總結(jié)和分類，并對其應(yīng)用提出了建議；我們認(rèn)為未來比較會廣泛應(yīng)用的三個生物3D打印技術(shù)是投影式光固化打印、懸浮支撐打印及同軸打�。欢�設(shè)計生物墨水的要點是在可打印性、生物相容性和機械性能三者中找到平衡點。

相關(guān)綜述以題為“Development of 3D Bioprinting: FromPrinting Methods to Biomedical Applications”被Asian Journalof Pharmaceutical Sciences在線刊登，顧則明博士生為一作，賀永教授為通訊作者。

我們認(rèn)為：生物3D打印技術(shù)仍有著很大的進步空間。組織/器官的復(fù)雜程度給精確的生物打印帶來了很大的困難，為解決這一問題，多尺寸、多材料、多細(xì)胞的生物打印將成為未來發(fā)展的重點。與天然組織/器官相比，生物打印的精度較低，這是目前生物打印技術(shù)的主要缺點之一。而另一個常見缺點是大尺寸復(fù)雜結(jié)構(gòu)的打印速度慢，特別是涉及到多材料交替打印。此外，作為生物3D打印關(guān)鍵應(yīng)用的體外組織模型不僅在尺寸上需要標(biāo)準(zhǔn)化，在生物相容性能和力學(xué)性能上也需要標(biāo)準(zhǔn)化，這就對生物打印技術(shù)的均勻性和再現(xiàn)性提出了更高的要求。相較于其他打印方法，投影式光固化生物3D打印技術(shù)在這些方面有著不小的優(yōu)勢。

生物墨水的開發(fā)和應(yīng)用是生物打印技術(shù)的關(guān)鍵。研究開發(fā)并穩(wěn)定合成能夠平衡可打印性、生物相容性和機械性能這三方面的新型生物墨水是生物3D打印應(yīng)用的基礎(chǔ)。目前的許多研究仍局限于使用有限范圍的生物材料，而大多數(shù)人體組織/器官都有ECM成分的復(fù)雜組合，具有特定的生物學(xué)或力學(xué)影響，單一的生物墨水不可能建立一個“合成”的微環(huán)境來模擬體內(nèi)的實際情況，這也使得多材料生物打印日益重要。

血管化是生物打印活體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)。與組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域面臨的挑戰(zhàn)一樣，確保打印結(jié)構(gòu)充分的血管化是生物3D打印的關(guān)鍵因素。有效構(gòu)建多尺度的灌注血管網(wǎng)絡(luò)，通過機械或化學(xué)刺激促進其血管化，是生物制造放大組織的基礎(chǔ)。雖然建立血管網(wǎng)絡(luò)的方法有多種，但每種方法都有其局限性，如噴墨生物打印和實驗室打印分辨率高，但難以構(gòu)建復(fù)雜的血管網(wǎng)絡(luò)；基于犧牲材料的生物打印需要一個復(fù)雜的二次成型過程；同軸生物打印具有構(gòu)建多尺寸流道的可行性和灌注培養(yǎng)的能力，在血管化領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。

實現(xiàn)功能化是生物3D打印的首要目標(biāo)。目前的大多數(shù)研究仍集中在打印過程和機制，這是面向制造業(yè)的想法，而生物3D打印功能化的核心因素是要從基礎(chǔ)研究到實際應(yīng)用。為實現(xiàn)功能化，生物墨水需要具備良好的生物相容性和力學(xué)性能，以滿足營養(yǎng)灌注和植入的要求。同時，構(gòu)建模擬體內(nèi)微環(huán)境的場景，包括力學(xué)和化學(xué)刺激，對打印結(jié)構(gòu)的功能化也至關(guān)重要。

3D打印就好比切土豆的逆過程，切土豆是將土豆加工成土豆片、土豆絲、土豆丁或土豆泥，而3D打印則是將土豆片、土豆絲、土豆丁或土豆泥反向組裝成土豆的過程，這四個過程就對應(yīng)了四種典型的3D打印工藝：采用投影光固化組裝的數(shù)字光處理（DLP）、采用纖維堆疊組裝的熔融沉積（FDM）、采用微球進行組裝的噴墨打印以及采用粉末燒結(jié)進行組裝的選擇性激光燒結(jié)（SLS）（圖1）。

而生物3D打印是一門與機械、材料、生物、醫(yī)學(xué)等多學(xué)科緊密相關(guān)的前沿技術(shù)。從廣義上來說，直接為生物醫(yī)療領(lǐng)域服務(wù)的3D打印都可視為生物3D打印的范疇，而從狹義上來定義，通常將操縱含細(xì)胞生物墨水構(gòu)造活性結(jié)構(gòu)的過程稱之為生物3D 打印，此概念也可稱之為細(xì)胞打印。我們系統(tǒng)總結(jié)了生物3D打印的發(fā)展歷程（圖2）和工藝流程（圖3）。



圖1 四種切土豆方式對應(yīng)四種典型3D打印工藝


圖2 生物3D打印回顧


圖3 生物3D打印工藝流程

根據(jù)不同的打印原理和打印材料，我們整理了生物3D打印的分類，把常見的生物3D打印方法分為了擠出式、液滴式、光固化式三類。簡單來說，擠出式生物打印通過擠出生物墨水形成連續(xù)纖維來搭建結(jié)構(gòu)；液滴式生物打印生成離散液滴堆積成型；光固化生物打印利用光敏材料進行光固化并逐層堆疊，實現(xiàn)三維模型。擠出式生物打印可根據(jù)不同的出液方式，分為氣動擠出式、活塞擠出式和螺旋擠出式三種（圖4）。


圖4 擠出式生物打印原理

依據(jù)不同的液滴成形原理，我們可以把液滴式生物打印分為噴墨式、電流體動力噴射式（EHDJ）和激光輔助式（LAB）等。這其中，噴墨式生物打印常見的有熱泡式、壓電式等，而激光輔助式生物打印又可細(xì)分為激光引導(dǎo)直寫（LGDW）和激光誘導(dǎo)前移(LIFT)（圖5）。



圖5液滴式生物打印原理

光固化式生物打印可根據(jù)光掃描的方式不同分為立體光刻（SLA）和數(shù)字光處理（DLP）等。目前SLA技術(shù)在支架打印中應(yīng)用較多，但在載細(xì)胞打印的應(yīng)用并不多見。而DLP技術(shù)因其有著打印精度高、速度快、均一性好等優(yōu)點越來越受到學(xué)術(shù)界的關(guān)注（圖6）。



圖6 DLP打印原理

我們詳細(xì)描繪了不同生物打印方法在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用，包括在皮膚、骨/軟骨、神經(jīng)、肌肉/肌腱、脂肪、脊髓、血管/血管化、類器官、藥物研究/腫瘤模型、臨床應(yīng)用等方面的研究現(xiàn)狀，也總結(jié)概述了市場上知名的商業(yè)化生物打印設(shè)備，同時還對目前較為火熱的多材料生物打印（圖7）和同軸生物打�。▓D8）進行了細(xì)致的闡述。



圖7 多材料生物打印的應(yīng)用


圖8 同軸生物打印的應(yīng)用

各種生物打印方法被發(fā)明出來用以針對不同的應(yīng)用場景，相應(yīng)地，每種生物打印方法也有著各自的優(yōu)缺點。

擠出式生物打印是目前應(yīng)用最為廣泛的生物打印方法，其最大的優(yōu)勢在于可打印的生物相容材料范圍廣泛（包括細(xì)胞團、載細(xì)胞水凝膠、微載體、脫細(xì)胞基質(zhì)成分等），涵蓋了粘度范圍從30mPa/s 到6×10^7mPa/s的生物材料，尤其是具有剪切變稀、快速交聯(lián)特性的水凝膠材料。這意味著能為維持細(xì)胞活力和功能化提供合適微環(huán)境的低粘度材料，與能為打印結(jié)構(gòu)提供力學(xué)支持的高粘度材料都能與擠出式生物打印很好地結(jié)合。同時，擠出式生物打印也有著良好的經(jīng)濟性和易用性等優(yōu)點，與多材料、同軸生物打印可緊密結(jié)合。但擠出式生物打印也有著一些缺陷：首先，其打印精度相對其他生物打印方式較低，一般在100μm量級；其次，生物墨水的選擇需要兼顧凝膠化、固化、剪切變稀等性質(zhì)；此外，由于擠出過程中不可避免的剪切力可能會影響細(xì)胞存活率，這在打印細(xì)胞密度較高的生物墨水時更為明顯。

噴墨式生物打印有著成本低、精度高、速度快等優(yōu)點，也可針對性地配備多個噴嘴，以滿足在同一時間打印不同的細(xì)胞、生物材料或生長因子的需求。然而，用于噴墨打印的生物墨水粘度要求限制了其適用生物材料的范圍；由于驅(qū)動壓力小，噴墨生物打印無法打印高粘度材料或高濃度細(xì)胞，用噴墨技術(shù)實現(xiàn)生理細(xì)胞密度的生物打印是目前比較困難的，而低粘度材料會降低打印成型的結(jié)構(gòu)強度，導(dǎo)致不滿足后續(xù)體外培養(yǎng)和移植的要求；此外，噴墨打印過程中可能會對細(xì)胞造成機械或熱損傷，噴頭也易損耗，這些缺點限制了噴墨生物打印技術(shù)的廣泛應(yīng)用。

激光輔助式生物打印相較于前兩者有著一個先天優(yōu)勢：其無噴嘴的打印模式就避免了細(xì)胞/生物材料堵塞噴嘴的問題；同時這也避免了生物墨水與器件的直接接觸，這種非接觸式制造方法不會對細(xì)胞造成機械損傷。其打印高粘度生物墨水的生物材料選擇范圍比噴墨打印更廣，打印精度甚至能達到生成含單個細(xì)胞的液滴。但激光輔助生物打印有幾個明顯的缺點：首先，成本相對較高，且缺乏商業(yè)化的打印設(shè)備，而適合激光生物打印的水凝膠材料并不多；其次，該方法自動化程度不高，如LIFT原理所述，每層墨水靠一次次涂層上去，不僅均一性得不到保證，且費時費力，導(dǎo)致其很難應(yīng)用于復(fù)雜結(jié)構(gòu)打印。

DLP是一種基于面投影的生物3D打印方法，相比應(yīng)用廣泛的擠出式打印有著更高的打印分辨率和可重復(fù)性。根據(jù)DLP的成型原理，它在打印速度上有很大的優(yōu)勢，因為無論結(jié)構(gòu)多么復(fù)雜，每一層的打印時間都不會增加。此外，與噴墨生物打印中液滴之間、或擠出式打印的相鄰纖維之間形成的“邊界”相比，DLP技術(shù)可以更平滑地堆疊三維結(jié)構(gòu)，從而大大提高了結(jié)構(gòu)的完整性和力學(xué)性能。在光固化打印工藝中，未固化的液態(tài)生物墨水可以為打印結(jié)構(gòu)提供良好的支撐，避免打印過程中水凝膠的坍塌變形；與LAB相同，無噴嘴的打印模式使得噴嘴堵塞、剪切力影響細(xì)胞活性等問題不再是困擾。我們認(rèn)為，光固化生物打印技術(shù)將在細(xì)胞生物打印技術(shù)中發(fā)揮越來越重要的作用，有望取代擠出式生物打印成為未來最為主流的生物3D打印技術(shù)。

而生物墨水的性能大致可從三個方面予以評價：可打印性、生物相容性和機械性能（圖9）。可打印性是評估生物墨水的可成型性，包括可調(diào)節(jié)的生物材料粘度、從溶膠態(tài)到凝膠態(tài)的快速轉(zhuǎn)換性質(zhì)，以及大范圍的可打印參數(shù)等。生物相容性要求生物墨水盡可能地與人體中細(xì)胞微環(huán)境相似，使細(xì)胞在其中增殖、擴展、分化并交互。機械性能要求凝膠態(tài)的生物墨水力學(xué)性能夠強，以支持隨后的培養(yǎng)和植入過程；生物打印的結(jié)構(gòu)通常需要在體外培養(yǎng)，在此期間常常伴隨著營養(yǎng)物質(zhì)的灌注和降解，需要相當(dāng)?shù)膹姸戎С�；機械性能不足也會導(dǎo)致移植失敗。



圖9 生物墨水性能的評價標(biāo)準(zhǔn)

文章來源：
https://doi.org/10.1016/j.ajps.2019.11.003