生物3D打印C形軟骨-纖維交替仿生氣管即刻修復(fù)節(jié)段性氣管缺損

來源： 數(shù)字醫(yī)學(xué)與生物3D打印

近期，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院華宇杰、周廣東教授和上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海市同仁醫(yī)院王曉云主任在科愛創(chuàng)辦的期刊Bioactive Materials上聯(lián)合發(fā)表研究論文：針對(duì)氣管仿生結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)與功能重建需求，研究者分別制備了適配軟骨、纖維再生的基質(zhì)微環(huán)境仿生水凝膠（后稱“基質(zhì)膠”）作為組織特異性生物墨水，通過生物3D打印技術(shù)構(gòu)建C形軟骨-纖維交替仿生氣管，并采用一步式端端吻合修復(fù)術(shù)成功實(shí)現(xiàn)了節(jié)段性氣管缺損修復(fù)與功能重建，從而摒棄了傳統(tǒng)的“氣管旁肌肉預(yù)埋植+帶蒂移植端端吻合”的兩步式修復(fù)術(shù)。

節(jié)段性氣管缺損修復(fù)與功能重建是臨床重大挑戰(zhàn)。目前，含細(xì)胞生物3D打印技術(shù)作為一種構(gòu)建具有異質(zhì)結(jié)構(gòu)工程化組織或器官的新策略，有望提供生理結(jié)構(gòu)仿生且功能健全的氣管移植物。前期研究中，該團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)并制備了光交聯(lián)脫細(xì)胞基質(zhì)水凝膠以提供適配軟骨/纖維特異性微環(huán)境，并結(jié)合生物3D打印技術(shù)成功實(shí)現(xiàn)了O形軟骨-纖維交替仿生氣管（CVFIT），進(jìn)一步通過“氣管旁肌肉預(yù)埋植+帶蒂移植端端吻合”兩步式修復(fù)術(shù)實(shí)現(xiàn)了節(jié)段性氣管缺損修復(fù)與功能重建（Adv. Sci. 2022, 2202181）。但是，目前仍然在復(fù)雜生物墨水設(shè)計(jì)、C形氣管結(jié)構(gòu)精準(zhǔn)仿生、多步修復(fù)手術(shù)模式等方面制約著生物3D打印仿生氣管的臨床轉(zhuǎn)化�；�于此，研究者提出了一種運(yùn)用生物3D打印C形仿生氣管直接端端吻合原位修復(fù)節(jié)段性氣管缺損的新策略（如示意圖所示）。

示意圖 基于組織特異性基質(zhì)膠的生物3D打印C形軟骨-纖維交替仿生氣管即刻修復(fù)節(jié)段性氣管缺損的示意圖

一、光交聯(lián)基質(zhì)膠的理化性能表征
研究者選用具有光交聯(lián)特性的天然高分子材料作為組織特異性生物墨水的基本成分，即選用可打印性的甲基丙烯�；�明膠（GM) 和軟骨組織來源的甲基丙烯�；�硫酸軟骨素（CM）制備軟骨特異性基質(zhì)膠（GC-gel）；選用GM和纖維組織來源的甲基丙烯酰化彈性蛋白（EM）制備纖維特異性基質(zhì)膠（GE-gel）。如圖1所示，GC-gel和GE-gel基質(zhì)膠具有較快的光交聯(lián)速度（GC-gel：3.4±0.2 s；GE-gel：9.1±0.4 s）、差異化的剪切模量（GC-gel：3.9±0.3 KPa；GE-gel：0.7±0.05 KPa），以及合適的溶脹率和酶降解特性，能夠滿足組織再生支架材料的基本要求。

圖1 光交聯(lián)基質(zhì)膠的理化性能表征

二、各向異性氣管仿生結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)
為了精準(zhǔn)模擬氣管硬-軟組織交替結(jié)構(gòu)，研究者精心設(shè)計(jì)了兩種不同力學(xué)強(qiáng)度的基質(zhì)膠。如圖2所示，在柔軟的GM網(wǎng)絡(luò)中引入高交聯(lián)密度的CM網(wǎng)絡(luò)，能夠顯著提高壓縮模量（從8.0±0.1 KPa提高到31.2±0.8 KPa）；而引入低交聯(lián)密度的EM網(wǎng)絡(luò)，則略微降低壓縮模量（6.8±0.3 KPa）。接著，O形和C形氣管模型有限元分析表明：貫通的C形結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)有效增強(qiáng)了VF環(huán)和C-C環(huán)之間的一體化整合。另外，C形管狀結(jié)構(gòu)不僅可以通過剛性軟骨環(huán)承受平行于C形位置的機(jī)械應(yīng)力；而且由于剛性軟骨區(qū)域之間存在柔性間隙，C形管狀結(jié)構(gòu)可以有效耗散垂直于C形位置的機(jī)械應(yīng)力。以上結(jié)果表明，采用GC-gel基質(zhì)膠作為CVFIT的剛性部分，GE-gel基質(zhì)膠作為CVFIT的柔性部分，能夠?qū)崿F(xiàn)硬-軟組織交替結(jié)構(gòu)、以及適應(yīng)各向異性力學(xué)環(huán)境的仿生氣管構(gòu)建。

圖2 各向異性氣管仿生結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)與有限元分析

三、生物3D打印仿生氣管的表征
組織特異性生物墨水的可打印性是生物3D打印仿生氣管的基本要求。如圖3所示，研究者首先證明GC-gel和GE-gel基質(zhì)膠具有固有的擠出成型能力，并優(yōu)化了生物3D打印技術(shù)參數(shù)（如打印壓力、打印速度）。接著，通過雙噴頭交替式生物3D打印技術(shù)分別構(gòu)建了O形和C形CVFIT仿生氣管。實(shí)驗(yàn)結(jié)構(gòu)表明，熒光標(biāo)記的軟骨細(xì)胞（紅色）和成纖維細(xì)胞（綠色）呈現(xiàn)交替分布于C形管狀結(jié)構(gòu)中，從而證實(shí)基于組織特異性生物墨水的生物3D打印技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)含多種細(xì)胞的異質(zhì)結(jié)構(gòu)構(gòu)建。

圖3 生物3D打印仿生氣管構(gòu)建與結(jié)構(gòu)表征

四、體內(nèi)氣管再生與功能評(píng)價(jià)

為了探討體內(nèi)氣管再生的可行性，研究者將生物3D打印仿生氣管（C形CVFIT為實(shí)驗(yàn)組；O形CVFIT為對(duì)照組）植入裸鼠皮下，并系統(tǒng)進(jìn)行了大體觀、力學(xué)性能、組織學(xué)染色、定量檢測評(píng)價(jià)。如圖4所示，由于CVFIT初始力學(xué)強(qiáng)度以及硅膠管內(nèi)支撐，再生氣管的管腔結(jié)構(gòu)得以長期維持。同時(shí)，C形再生氣管呈現(xiàn)軟骨-纖維交替結(jié)構(gòu)，以及C形軟骨間隙。力學(xué)測試結(jié)果表明：再生的O形和C形氣管均表現(xiàn)出類似的力學(xué)特性，即徑向壓縮性、側(cè)向柔韌性和抗疲勞性。此外，再生的C形氣管具有各向異性的壓縮能力，這是由于C形結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)可以有效耗散機(jī)械能，有利于正常氣管力學(xué)功能重建。組織學(xué)結(jié)果表明：再生的C形氣管具有C形軟骨-纖維交替結(jié)構(gòu)以及組織特異性ECM沉積（如圖5所示）。定量結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，再生氣管的力學(xué)強(qiáng)度、膠原蛋白和糖胺聚糖的含量接近于天然氣管。

圖4 裸鼠皮下生物3D打印仿生氣管植入與功能評(píng)價(jià)

圖5 體內(nèi)再生氣管的組織學(xué)評(píng)價(jià)

五、節(jié)段性氣管缺損修復(fù)評(píng)價(jià)
最后，研究者采用一步式端端吻合修復(fù)術(shù)，運(yùn)用生物3D打印C形仿生氣管進(jìn)行兔節(jié)段性氣管缺損修復(fù)與功能評(píng)價(jià)。如圖6所示，基于生物3D打印技術(shù)的一步式端端吻合修復(fù)術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)節(jié)段性氣管缺損的即刻修復(fù)與功能重建。術(shù)后8周，重建氣管呈現(xiàn)完整、連續(xù)的C形管腔結(jié)構(gòu)，以及內(nèi)表面光滑、通氣良好、與天然氣管無縫整合。組織學(xué)評(píng)價(jià)表明：C形仿生氣管可以實(shí)現(xiàn)與天然氣管類似的軟骨-纖維交替結(jié)構(gòu)的組織再生與上皮化功能重建。因此，本研究證實(shí)了利用生物3D打印C形仿生氣管可以作為一種替代的節(jié)段性氣管缺損修復(fù)策略，能夠?qū)崿F(xiàn)快速、高效的氣管缺損修復(fù)與功能重建。

圖6 兔節(jié)段性氣管缺損修復(fù)及組織學(xué)評(píng)價(jià)

第一/通訊作者簡介

第一作者： 孫玉艷：山東省濰坊醫(yī)學(xué)院與上海市組織工程研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合培養(yǎng)碩士研究生，主要從事軟骨再生及氣管重建研究。

通訊作者：
華宇杰：上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院助理研究員、新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院特聘教授，依托于上海市組織工程研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、組織工程國家工程研究中心開展科研工作，研究方向聚焦于微環(huán)境仿生水凝膠構(gòu)筑及調(diào)控硬/軟組織再生，通過建立雜化交聯(lián)、基質(zhì)仿生、動(dòng)態(tài)調(diào)控等水凝膠構(gòu)筑技術(shù)，成功實(shí)現(xiàn)骨、關(guān)節(jié)、氣管、尿道、皮膚等多種組織再生與缺損修復(fù)。目前以第一/通訊作者在Sci. Adv., Nat. Commun., Bioact. Mater., Adv. Sci., Adv. Healthc. Mater., ACS Appl. Mater. Inter., Mater. Today Bio, Appl. Mater. Today, ACS Macro Lett.等學(xué)術(shù)期刊發(fā)表SCI論文20余篇，累計(jì)影響因子大于250，申請(qǐng)/授權(quán)國家發(fā)明專利10余項(xiàng)，主持國自然青年基金、參與國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（子課題負(fù)責(zé)人）等項(xiàng)目，擔(dān)任中國生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)會(huì)組織工程與再生醫(yī)學(xué)分會(huì)青年委員，獲第一屆全國博士后創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)大賽優(yōu)勝獎(jiǎng)。

王曉云：上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海市同仁醫(yī)院整形外科教授、主任醫(yī)師，副研究員資格。國家十三五、十四五重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目子課題骨干專家，曾參與多項(xiàng)國家863、973項(xiàng)目/課題研究，主持并完成國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目及國家博士后科研基金等項(xiàng)目。曾任中國生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)會(huì)組織工程與再生醫(yī)學(xué)分會(huì)青年委員，現(xiàn)任國家自然科學(xué)基金委評(píng)審專家?guī)鞂＜页蓡T，中國醫(yī)藥文化協(xié)會(huì)醫(yī)工融合分會(huì)細(xì)胞治療技術(shù)和設(shè)備學(xué)組委員，組織工程國家工程研究中心床轉(zhuǎn)化研究特邀專家，近年來以第一/通訊作者在Bioact. Mater., Adv. Healthc. Mater., Front. Bioeng. Biotechnol., Appl. Mater. Today., ACS Appl. Mater. Inter.等學(xué)術(shù)期刊發(fā)表SCI論文8篇，累計(jì)影響因子大于50，第一發(fā)明人授權(quán)國家技術(shù)發(fā)明專利2項(xiàng)。

周廣東：上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院教授、研究員、博士生導(dǎo)師，組織工程國家工程研究中心常務(wù)副主任，上海市組織工程研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主任，國家十三五重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目首席科學(xué)家，多項(xiàng)國家863、973項(xiàng)目/課題負(fù)責(zé)人，教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才，泰山學(xué)者特聘教授，上海市優(yōu)秀技術(shù)帶頭人，上海市醫(yī)學(xué)領(lǐng)軍人才。主攻骨軟骨再生核心技術(shù)及其臨床轉(zhuǎn)化，涉及軟骨/骨再生核心技術(shù)、組織再生調(diào)控機(jī)制、微環(huán)境仿生模擬、大動(dòng)物缺損修復(fù)、再生技術(shù)臨床應(yīng)用及產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)化等領(lǐng)域，在國際上率先實(shí)現(xiàn)了關(guān)節(jié)、耳、鼻、鼻甲、瞼板、氣管、唇腭裂、半側(cè)顏面萎縮等多種骨軟骨缺損與先天畸形再生修復(fù)重建的臨床轉(zhuǎn)化突破，開創(chuàng)了活體組織再生再造全新治療模式，累計(jì)啟動(dòng)各類活體組織再生技術(shù)臨床轉(zhuǎn)化研究22項(xiàng)，已完成各類骨軟骨缺損再生修復(fù)與畸形矯治200余例，獲國家技術(shù)發(fā)明二等獎(jiǎng)、山東省科技進(jìn)步一等獎(jiǎng)、全國創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)大賽優(yōu)秀獎(jiǎng)。

資助信息：
該研究獲得了國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2022YFA1207500）、國家自然科學(xué)基金（82302823、81871502、81671837）、上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物材料與再生醫(yī)學(xué)研究院聯(lián)合攻關(guān)項(xiàng)目（2022LHA07）、上海市科技重大專項(xiàng)（21Y11911700）、上海市臨床重點(diǎn)�？疲╯hslczdzk06601）、河南省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（221111310100）等項(xiàng)目資助。

原文信息
Yuyan Sun, YingyingHuo, Xinyue Ran, Hongying Chen, Qingqing Pan, Yujie Chen, Ying Zhang, WenjieRen, Xiaoyun Wang*, Guangdong Zhou*, Yujie Hua*.

Instant trachea reconstruction using 3D-bioprinted C-shape biomimetic trachea based on tissue-specific matrix hydrogels.

BioactiveMaterials, 32 (2024) 52-65.

https://10.1016/j.bioactmat.2023.09.011