TIBI研究人員成功3D 打印肌肉組織，為肌肉修復(fù)和再生提供新療法

導(dǎo)讀：近年來，增材制造行業(yè)經(jīng)歷了強(qiáng)勁增長，并在眾多專業(yè)領(lǐng)域開辟了新的機(jī)遇。除了汽車行業(yè)或航空航天領(lǐng)域之外，3D 打印的應(yīng)用也越來越廣泛，尤其是在醫(yī)療領(lǐng)域涌現(xiàn)了許多創(chuàng)新案例。

2023年9月15日，南極熊獲悉，Terasaki 生物醫(yī)學(xué)創(chuàng)新研究所 (TIBI) 的科學(xué)家在類天然骨骼肌組織的 3D 生物打印方面取得了進(jìn)展：研究人員針對受損肌肉組織的恢復(fù)開發(fā)了一種新的治療方法，首次實(shí)現(xiàn)了3D 打印肌肉組織的生產(chǎn)和試驗(yàn)。TIBI 科學(xué)家方法的關(guān)鍵在于他們專門配制的生物墨水，其中含有專為持續(xù)輸送胰島素樣生長因子-1 (IGF-1) 而設(shè)計(jì)的微粒。

相關(guān)研究以題為“Enhanced Maturation of 3DBioprinted Skeletal Muscle Tissue Constructs Encapsulating SolubleFactor-Releasing Microparticles”的論文被發(fā)表在《MacromolecularBioscience》期刊上。

相關(guān)論文鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/mabi.202300276

由于創(chuàng)傷、疾病或外科手術(shù)而導(dǎo)致的骨骼肌損失不僅會導(dǎo)致功能障礙，還會對相關(guān)組織（例如血管和其他結(jié)構(gòu)組織）造成損害。目前對這種肌肉損失的治療是將患者的健康肌肉組織從不同部位轉(zhuǎn)移到受傷部位。然而，移植組織的神經(jīng)支配不足和其他并發(fā)癥可能會阻礙肌肉的全面恢復(fù)。肌肉發(fā)育的正常過程是漸進(jìn)的，其中稱為成肌細(xì)胞的圓形肌肉前體細(xì)胞融合形成稱為肌管的管狀細(xì)胞。這些肌管最終發(fā)育成成熟的肌纖維。除了肌肉細(xì)胞成熟之外，精確的細(xì)胞排列和定向?qū)τ诔晒Φ募∪馐湛s和功能也至關(guān)重要。

人們已經(jīng)努力對功能性骨骼肌組織進(jìn)行生物工程改造，但大多數(shù)方法都面臨著各自的挑戰(zhàn)。例如，嘗試使用靜電紡絲方法工程化類似天然的骨骼肌組織，已經(jīng)產(chǎn)生了具有適當(dāng)?shù)慕Y(jié)構(gòu)排列和方向的肌肉組織，用于修復(fù)和再生；然而，組織的細(xì)胞成熟和肌肉收縮的能力已被證明是不夠的。

為了解決這個問題，Terasaki研究所的研究人員嘗試采用 3D 生物打印技術(shù)，并開發(fā)由 GelMA（一種生物相容性明膠水凝膠）、成肌細(xì)胞和專為持續(xù)遞送 IGF-1 設(shè)計(jì)的微粒組成的生物墨水。這種生物墨水能夠模仿自然肌肉的形成，以生成合成肌肉組織。這項(xiàng)創(chuàng)新技術(shù)有望成為解決因受傷、疾病或手術(shù)而導(dǎo)致肌肉損失的一種新的治療方案。

△該生物墨水由水凝膠、成肌細(xì)胞和微粒組成（照片來源：Terasaki研究所）

△可溶性因子釋放生物墨水的示意圖。A) GelMA 凝膠與負(fù)載有生長因子 IGF-1 的 PLGA 微粒相結(jié)合，產(chǎn)生 B) 可溶性因子釋放生物墨水。C）所得生物墨水可以進(jìn)行3D打印，共價光交聯(lián)后對細(xì)胞友好且穩(wěn)定。D) GelMA 3D 打印纖維與 PLGA/IGF-1 微粒相結(jié)合，為細(xì)胞生長、排列和分化為 E) 肌肉微組織提供了最佳條件。（比例尺：C）2 毫米；E）100微米）。

△微流體輔助制造聚合物微粒。A) 微流體 T 形連接裝置的方案。B)氧等離子體和 PVA 涂層處理的接觸角（****  p  <0.0001；*** p  < 0.001；**  p  < 0.01；*  p  <0.05）。C) 來自微流體裝置和 T 形接頭設(shè)計(jì)中的 PLGA 液滴生成的圖像，隨后是獲得清潔和干燥的 PLGA 微粒的步驟（比例尺：3 毫米；1 毫米）。D) 干燥球形 PLGA 微粒的 SEM 圖像（比例尺：40 µm）。E) 平均直徑和多分散指數(shù)。

△PLGA 微粒與帶正電荷的蛋白質(zhì)相互作用。A) PLGA 微粒與 FITC-BSA 相互作用的熒光顯微鏡圖像（比例尺：100 µm）。PLGA 微粒吸附的 B) BSA 和C) IGF-1 的定量。D) IGF-1 從 PLGA 微粒中釋放。E) IGF-1 從封裝在 GelMA 水凝膠中的 PLGA 微粒中釋放。

△包含 PLGA/IGF-1 微粒和 C2C12 細(xì)胞的 3D 生物打印結(jié)構(gòu)。A) 3D 生物打印過程示意圖，隨后進(jìn)行細(xì)胞排列和分化。B) 第 3 天的活-死熒光測定�；罴�(xì)胞用鈣黃綠素（綠色）染色，死細(xì)胞用碘化丙啶（紅色）染色。CD) 培養(yǎng) 3 天后生物打印細(xì)胞的DAPI/肌動蛋白熒光染色。細(xì)胞核用 DAPI（藍(lán)色）染色，肌動蛋白絲用鬼筆環(huán)肽（綠色）染色（D：比例尺為 40 µm）。EG）第 7 天含有 PLGA/IGF-1 微粒的水凝膠內(nèi)肌管形成的免疫熒光和明場圖像。比例尺：100 µm。

△肌管形態(tài)的表征。A) 在含有 PLGA 或PLGA/IGF-1 微粒的水凝膠中形成的肌管的代表性 MHC（綠色）免疫熒光染色（比例尺：100 µm）。B) 在含有 PLGA 和 PLGA/IGF-1 微粒的水凝膠中培養(yǎng)后肌管的長度、直徑、長寬比和面積的分析。p值<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)顯著性。( ****  p  <0.0001; ***  p <  0.001; ** p  < 0.01; *  p < 0.05）。C) 摻入 PLGA 和 PLGA/IGF-1 微粒的水凝膠中肌管角度的定量。直方圖顯示了肌管在水凝膠方向上的排列分布。

△GelMA/PLGA/IGF-1 水凝膠打印后 10 天的肌管抽搐特征。A) 電影（電影 S1，支持信息）的屏幕截圖，顯示包含 C2C12 細(xì)胞和 PLGA/IGF-1 微粒的水凝膠的自發(fā)收縮。黃色箭頭顯示水凝膠的自發(fā)抽搐運(yùn)動（比例尺：100 µm）。B) 包含 C2C12 細(xì)胞和 PLGA/IGF-1 微粒的水凝膠的電影（電影S2 ，支持信息）的屏幕截圖以及相應(yīng)的 MHC（綠色）免疫熒光染色。CD) 分析含有 PLGA 和 PLGA/IGF-1 微粒的生物墨水中發(fā)達(dá)肌肉組織的抽搐面積和抽搐幅度。p值<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)顯著性。（****p  < 0.0001；*** p  < 0.001；** p  < 0.01；* p  < 0.05）。

△使用 CD68、F4/80 和核染色對皮下植入物進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。A) 皮下植入 4 周后，帶有 CD68、F4/80 和核染色的薄樣品的寬場熒光圖像（比例尺 X4：430 µm，X10：170 µm。紅色：F4/80，綠色：CD68 和藍(lán)色：DAPI）。B) 厚組織切片的 CLSM z 堆棧圖像（比例尺：150 和 50 µm。洋紅色：泛單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞標(biāo)記，青色：細(xì)胞核）。

△術(shù)后六周進(jìn)行體內(nèi) VML 評估。不同成分（GelMA/PLGA/IGF-1、GelMA/PLGA 和 GelMA/IGF-1）的 GelMA 植入物的 VML 模型評估，無治療對照為假模型。對樣品進(jìn)行蘇木精和曙紅染色（比例尺左圖：500 µm，右圖：100 µm）。

肌肉組織的生成是一項(xiàng)復(fù)雜的任務(wù)，因?yàn)樗�由不同的�?xì)胞類型組成，并受到生化和生物力學(xué)信號通路的調(diào)節(jié)。研究人員重點(diǎn)關(guān)注生長因子-1 (IGF-1) 的使用，這是一種具有類胰島素結(jié)構(gòu)的激素，是正常骨骼和組織生長所需的。持續(xù)輸送 IGF-1 可以增強(qiáng)肌肉前體細(xì)胞形成成熟骨骼肌組織，并促進(jìn)其結(jié)構(gòu)排列。這提高了再生過程的效率，并可以為遭受肌肉損失或受傷的人帶來成功的治療。

打印三天后，成肌細(xì)胞被認(rèn)為是可行的，IGF-1 存在至少十天后可促進(jìn)肌肉再生和修復(fù)并發(fā)育成l 完整的合成肌肉組織，。為了使 IGF-1 持續(xù)釋放數(shù)天，研究人員使用微流體系統(tǒng)制造了涂有 IGF-1 的大小均勻的微粒。隨著顆粒的降解，IGF-1逐漸從微粒表面釋放。

使用新的生物墨水創(chuàng)建肌肉結(jié)構(gòu)一周后，研究人員觀察到成肌細(xì)胞排列、融合和分化為肌管的能力增強(qiáng)，并且與沒有持續(xù)釋放 IGF-1 的結(jié)構(gòu)相比，肌管的生長和伸長顯著增加。有趣的是，生物打印十天后，持續(xù)釋放IGF-1 的肌肉組織結(jié)構(gòu)開始自發(fā)收縮。

對植入 3D 生物打印肌肉組織結(jié)構(gòu)的小鼠進(jìn)行了臨床前研究。那些植入可持續(xù)釋放 IGF-1 的肌肉組織結(jié)構(gòu)的小鼠在植入六周后表現(xiàn)出最高程度的肌肉組織再生。其他體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，IGF-1 的持續(xù)釋放還引發(fā)了良好調(diào)節(jié)的炎癥反應(yīng)，這被證明有利于組織修復(fù)。

TIBI 董事兼首席執(zhí)行官 AliKhademhosseini 博士說：“IGF-1 的持續(xù)釋放促進(jìn)肌肉細(xì)胞的成熟和排列，這是肌肉組織修復(fù)和再生的關(guān)鍵一步。利用這種策略來治療性地創(chuàng)建功能性、收縮性肌肉組織具有巨大的潛力�！�

3D 打印肌肉組織代表了醫(yī)學(xué)的重大進(jìn)步。通過模仿肌肉形成的自然過程，這項(xiàng)技術(shù)可以徹底改變肌肉質(zhì)量的替代。目前，還需要進(jìn)一步的臨床研究和測試，以便在治療人類之前確認(rèn)這一過程的安全性。然而可以肯定的是，3D 打印肌肉組織為醫(yī)學(xué)的未來提供了非常有希望的前景。