TIBI研究人員成功3D 打印肌肉組織，為肌肉修復和再生提供新療法

導讀：近年來，增材制造行業(yè)經歷了強勁增長，并在眾多專業(yè)領域開辟了新的機遇。除了汽車行業(yè)或航空航天領域之外，3D 打印的應用也越來越廣泛，尤其是在醫(yī)療領域涌現(xiàn)了許多創(chuàng)新案例。

2023年9月15日，南極熊獲悉，Terasaki 生物醫(yī)學創(chuàng)新研究所 (TIBI) 的科學家在類天然骨骼肌組織的 3D 生物打印方面取得了進展：研究人員針對受損肌肉組織的恢復開發(fā)了一種新的治療方法，首次實現(xiàn)了3D 打印肌肉組織的生產和試驗。TIBI 科學家方法的關鍵在于他們專門配制的生物墨水，其中含有專為持續(xù)輸送胰島素樣生長因子-1 (IGF-1) 而設計的微粒。

相關研究以題為“Enhanced Maturation of 3DBioprinted Skeletal Muscle Tissue Constructs Encapsulating SolubleFactor-Releasing Microparticles”的論文被發(fā)表在《MacromolecularBioscience》期刊上。

相關論文鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/mabi.202300276

由于創(chuàng)傷、疾病或外科手術而導致的骨骼肌損失不僅會導致功能障礙，還會對相關組織（例如血管和其他結構組織）造成損害。目前對這種肌肉損失的治療是將患者的健康肌肉組織從不同部位轉移到受傷部位。然而，移植組織的神經支配不足和其他并發(fā)癥可能會阻礙肌肉的全面恢復。肌肉發(fā)育的正常過程是漸進的，其中稱為成肌細胞的圓形肌肉前體細胞融合形成稱為肌管的管狀細胞。這些肌管最終發(fā)育成成熟的肌纖維。除了肌肉細胞成熟之外，精確的細胞排列和定向對于成功的肌肉收縮和功能也至關重要。

人們已經努力對功能性骨骼肌組織進行生物工程改造，但大多數(shù)方法都面臨著各自的挑戰(zhàn)。例如，嘗試使用靜電紡絲方法工程化類似天然的骨骼肌組織，已經產生了具有適當?shù)慕Y構排列和方向的肌肉組織，用于修復和再生；然而，組織的細胞成熟和肌肉收縮的能力已被證明是不夠的。

為了解決這個問題，Terasaki研究所的研究人員嘗試采用 3D 生物打印技術，并開發(fā)由 GelMA（一種生物相容性明膠水凝膠）、成肌細胞和專為持續(xù)遞送 IGF-1 設計的微粒組成的生物墨水。這種生物墨水能夠模仿自然肌肉的形成，以生成合成肌肉組織。這項創(chuàng)新技術有望成為解決因受傷、疾病或手術而導致肌肉損失的一種新的治療方案。

△該生物墨水由水凝膠、成肌細胞和微粒組成（照片來源：Terasaki研究所）

△可溶性因子釋放生物墨水的示意圖。A) GelMA 凝膠與負載有生長因子 IGF-1 的 PLGA 微粒相結合，產生 B) 可溶性因子釋放生物墨水。C）所得生物墨水可以進行3D打印，共價光交聯(lián)后對細胞友好且穩(wěn)定。D) GelMA 3D 打印纖維與 PLGA/IGF-1 微粒相結合，為細胞生長、排列和分化為 E) 肌肉微組織提供了最佳條件。（比例尺：C）2 毫米；E）100微米）。

△微流體輔助制造聚合物微粒。A) 微流體 T 形連接裝置的方案。B)氧等離子體和 PVA 涂層處理的接觸角（****  p  <0.0001；*** p  < 0.001；**  p  < 0.01；*  p  <0.05）。C) 來自微流體裝置和 T 形接頭設計中的 PLGA 液滴生成的圖像，隨后是獲得清潔和干燥的 PLGA 微粒的步驟（比例尺：3 毫米；1 毫米）。D) 干燥球形 PLGA 微粒的 SEM 圖像（比例尺：40 µm）。E) 平均直徑和多分散指數(shù)。

△PLGA 微粒與帶正電荷的蛋白質相互作用。A) PLGA 微粒與 FITC-BSA 相互作用的熒光顯微鏡圖像（比例尺：100 µm）。PLGA 微粒吸附的 B) BSA 和C) IGF-1 的定量。D) IGF-1 從 PLGA 微粒中釋放。E) IGF-1 從封裝在 GelMA 水凝膠中的 PLGA 微粒中釋放。

△包含 PLGA/IGF-1 微粒和 C2C12 細胞的 3D 生物打印結構。A) 3D 生物打印過程示意圖，隨后進行細胞排列和分化。B) 第 3 天的活-死熒光測定�；罴毎�用鈣黃綠素（綠色）染色，死細胞用碘化丙啶（紅色）染色。CD) 培養(yǎng) 3 天后生物打印細胞的DAPI/肌動蛋白熒光染色。細胞核用 DAPI（藍色）染色，肌動蛋白絲用鬼筆環(huán)肽（綠色）染色（D：比例尺為 40 µm）。EG）第 7 天含有 PLGA/IGF-1 微粒的水凝膠內肌管形成的免疫熒光和明場圖像。比例尺：100 µm。

△肌管形態(tài)的表征。A) 在含有 PLGA 或PLGA/IGF-1 微粒的水凝膠中形成的肌管的代表性 MHC（綠色）免疫熒光染色（比例尺：100 µm）。B) 在含有 PLGA 和 PLGA/IGF-1 微粒的水凝膠中培養(yǎng)后肌管的長度、直徑、長寬比和面積的分析。p值<0.05被認為具有統(tǒng)計顯著性。( ****  p  <0.0001; ***  p <  0.001; ** p  < 0.01; *  p < 0.05）。C) 摻入 PLGA 和 PLGA/IGF-1 微粒的水凝膠中肌管角度的定量。直方圖顯示了肌管在水凝膠方向上的排列分布。

△GelMA/PLGA/IGF-1 水凝膠打印后 10 天的肌管抽搐特征。A) 電影（電影 S1，支持信息）的屏幕截圖，顯示包含 C2C12 細胞和 PLGA/IGF-1 微粒的水凝膠的自發(fā)收縮。黃色箭頭顯示水凝膠的自發(fā)抽搐運動（比例尺：100 µm）。B) 包含 C2C12 細胞和 PLGA/IGF-1 微粒的水凝膠的電影（電影S2 ，支持信息）的屏幕截圖以及相應的 MHC（綠色）免疫熒光染色。CD) 分析含有 PLGA 和 PLGA/IGF-1 微粒的生物墨水中發(fā)達肌肉組織的抽搐面積和抽搐幅度。p值<0.05被認為具有統(tǒng)計顯著性。（****p  < 0.0001；*** p  < 0.001；** p  < 0.01；* p  < 0.05）。

△使用 CD68、F4/80 和核染色對皮下植入物進行免疫組織化學染色。A) 皮下植入 4 周后，帶有 CD68、F4/80 和核染色的薄樣品的寬場熒光圖像（比例尺 X4：430 µm，X10：170 µm。紅色：F4/80，綠色：CD68 和藍色：DAPI）。B) 厚組織切片的 CLSM z 堆棧圖像（比例尺：150 和 50 µm。洋紅色：泛單核細胞/巨噬細胞標記，青色：細胞核）。

△術后六周進行體內 VML 評估。不同成分（GelMA/PLGA/IGF-1、GelMA/PLGA 和 GelMA/IGF-1）的 GelMA 植入物的 VML 模型評估，無治療對照為假模型。對樣品進行蘇木精和曙紅染色（比例尺左圖：500 µm，右圖：100 µm）。

肌肉組織的生成是一項復雜的任務，因為它由不同的細胞類型組成，并受到生化和生物力學信號通路的調節(jié)。研究人員重點關注生長因子-1 (IGF-1) 的使用，這是一種具有類胰島素結構的激素，是正常骨骼和組織生長所需的。持續(xù)輸送 IGF-1 可以增強肌肉前體細胞形成成熟骨骼肌組織，并促進其結構排列。這提高了再生過程的效率，并可以為遭受肌肉損失或受傷的人帶來成功的治療。

打印三天后，成肌細胞被認為是可行的，IGF-1 存在至少十天后可促進肌肉再生和修復并發(fā)育成l 完整的合成肌肉組織，。為了使 IGF-1 持續(xù)釋放數(shù)天，研究人員使用微流體系統(tǒng)制造了涂有 IGF-1 的大小均勻的微粒。隨著顆粒的降解，IGF-1逐漸從微粒表面釋放。

使用新的生物墨水創(chuàng)建肌肉結構一周后，研究人員觀察到成肌細胞排列、融合和分化為肌管的能力增強，并且與沒有持續(xù)釋放 IGF-1 的結構相比，肌管的生長和伸長顯著增加。有趣的是，生物打印十天后，持續(xù)釋放IGF-1 的肌肉組織結構開始自發(fā)收縮。

對植入 3D 生物打印肌肉組織結構的小鼠進行了臨床前研究。那些植入可持續(xù)釋放 IGF-1 的肌肉組織結構的小鼠在植入六周后表現(xiàn)出最高程度的肌肉組織再生。其他體內實驗表明，IGF-1 的持續(xù)釋放還引發(fā)了良好調節(jié)的炎癥反應，這被證明有利于組織修復。

TIBI 董事兼首席執(zhí)行官 AliKhademhosseini 博士說：“IGF-1 的持續(xù)釋放促進肌肉細胞的成熟和排列，這是肌肉組織修復和再生的關鍵一步。利用這種策略來治療性地創(chuàng)建功能性、收縮性肌肉組織具有巨大的潛力�！�

3D 打印肌肉組織代表了醫(yī)學的重大進步。通過模仿肌肉形成的自然過程，這項技術可以徹底改變肌肉質量的替代。目前，還需要進一步的臨床研究和測試，以便在治療人類之前確認這一過程的安全性。然而可以肯定的是，3D 打印肌肉組織為醫(yī)學的未來提供了非常有希望的前景。