改改交聯(lián)策略！3D打印海藻酸鈉生物墨水發(fā)了《Biofabrication》

來(lái)源： EngineeringForLife

生物打印是一種制造具有可控幾何形狀充滿(mǎn)細(xì)胞體積結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵技術(shù)。不僅可以用來(lái)復(fù)制目標(biāo)器官的結(jié)構(gòu)，還可以用來(lái)形成形狀，以便在體外模仿特定的理想特征。在適合用這種技術(shù)處理的各種材料中，海藻酸鈉因其多功能性而被認(rèn)為是目前最有前景的材料之一。到目前為止，最廣泛打印海藻酸鈉生物匯的策略是利用外部凝膠化作為主要過(guò)程，通過(guò)直接將水凝膠前體溶液擠壓到交聯(lián)浴中或在交聯(lián)水凝膠中發(fā)生凝膠化。近日，來(lái)自意大利米蘭理工大學(xué)的Paola Petrini教授團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了內(nèi)部交聯(lián)藻酸鹽基生物墨水制備體外肝組織模型的相關(guān)研究。研究成果以“Internally crosslinked alginate-based bioinks for the fabrication of in vitro hepatic tissue models”為題于5月24日發(fā)表在《Biofabrication》上。

本文研究了Hep3Gel的打印優(yōu)化和加工：一種內(nèi)部交聯(lián)的海藻酸鹽和ECM為基礎(chǔ)的生物墨水，用于生產(chǎn)大體積的肝臟組織模型。本文采取了一種非常規(guī)的策略，從再現(xiàn)肝臟組織幾何形狀和結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)向使用生物打印來(lái)制造能夠促進(jìn)高度氧合的結(jié)構(gòu)，如肝臟組織情況一樣。為此，通過(guò)采用計(jì)算方法對(duì)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化。然后通過(guò)不同先驗(yàn)和后驗(yàn)分析組合，研究和優(yōu)化了生物墨水的可打印性。制作了14層結(jié)構(gòu)，從而突出了利用內(nèi)部凝膠化直接打印具有精細(xì)控制粘彈性能的自立結(jié)構(gòu)的可能性。裝有HepG2細(xì)胞的結(jié)構(gòu)成功打印出來(lái)，并在靜態(tài)條件下培養(yǎng)了12天，證實(shí)Hep3Gel支持中/長(zhǎng)期培養(yǎng)的適宜性。

1. 3D生物打印增強(qiáng)氧擴(kuò)散數(shù)值模擬

圖1 通過(guò)結(jié)構(gòu)氧擴(kuò)散的數(shù)值模擬

進(jìn)行3D生物打印增強(qiáng)氧擴(kuò)散的數(shù)值模擬，評(píng)估以設(shè)計(jì)幾何為特征的靜態(tài)培養(yǎng)結(jié)構(gòu)可以達(dá)到的氧合程度。將這些結(jié)果與通過(guò)靜態(tài)培養(yǎng)結(jié)構(gòu)獲得的結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)是整個(gè)結(jié)構(gòu)具有零孔隙度水平。在這些模擬中，30分鐘后達(dá)到平衡。過(guò)渡階段（從0分鐘到30分鐘）的分析顯示了兩種幾何形狀之間的顯著差異并強(qiáng)調(diào)采用大孔結(jié)構(gòu)有利于構(gòu)建體的氧合。相反，無(wú)孔支架的特點(diǎn)是氧合的梯度從外圍到中心不斷下降。從數(shù)量上看，一旦達(dá)到平衡，大孔的幾何形狀比無(wú)孔的幾何結(jié)構(gòu)的氧合度高3-4倍。在30分鐘內(nèi)成功建立了均勻的氧合度，構(gòu)建體中的O值與新鮮培養(yǎng)基中的O值相同，驗(yàn)證了設(shè)計(jì)的幾何形狀。有鑒于此，打印的工程生物匯將圍繞這一特定形狀進(jìn)行優(yōu)化。

2. Hep3Gel粘彈性能和微觀結(jié)構(gòu)隨時(shí)間變化

圖2 Hep3Gel和對(duì)照材料的粘彈性能及微觀結(jié)構(gòu)隨時(shí)間變化情況

Hep3Gel和控制材料的隨時(shí)間變化的粘彈性能以下列方式進(jìn)行分測(cè)量的，保守模量（G）和損失模量（G"）是在水凝膠交聯(lián)過(guò)程中進(jìn)行。掃頻試驗(yàn)的結(jié)果表明在所檢查的時(shí)間點(diǎn)上，Hep3Gel、GEL和ALG樣品已經(jīng)越過(guò)了凝膠點(diǎn)，它們的保守模量G大于它們的損失模量G"。也可以觀察到粘彈性能的變化，G'隨著時(shí)間的推移而增加而損失模量G"幾乎沒(méi)有變化。在每個(gè)被檢查的樣品中逐漸減少也突出了這種特性。通過(guò)應(yīng)用廣義麥克斯韋模型得到的數(shù)據(jù)清楚表明，網(wǎng)目尺寸(即兩個(gè)相鄰交聯(lián)點(diǎn)之間的平均距離）隨著時(shí)間的推移而減少。這一趨勢(shì)在GEL和ALG樣品中幾乎不明顯，但在Hep3Gel中則明顯得多。

3. 打印參數(shù)的優(yōu)化

圖3 通過(guò)流變學(xué)分析對(duì)可打印性能進(jìn)行評(píng)估

Hep3Gel、GEL和ALG的粘彈性能總體趨勢(shì)是一致的。GEL和ALG有著極其相似的交聯(lián)動(dòng)力學(xué)。在交聯(lián)開(kāi)始后約1小時(shí)達(dá)到凝膠點(diǎn)。在不同的是，在Hep3Gel的情況下，凝膠化的進(jìn)展延遲，從"溶膠"到"凝膠相"的過(guò)渡是在從反應(yīng)開(kāi)始大約2小時(shí)后達(dá)到。此外，在24℃和37℃下，G'和G"的測(cè)量結(jié)果沒(méi)有明顯差異。表明了在所考慮的溫度范圍內(nèi)，水凝膠的粘彈性行為是獨(dú)立于溫度的，在生產(chǎn)GEL所采用的濃度下，明膠對(duì)交聯(lián)網(wǎng)的結(jié)構(gòu)沒(méi)有貢獻(xiàn)。一般的次級(jí)相互作用會(huì)受到受溫度變化的影響。所有水凝膠的粘彈性能與溫度無(wú)關(guān)。剪應(yīng)力振幅掃描（屈服測(cè)試）的數(shù)據(jù)表明在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，對(duì)于所有的材料，都有一個(gè)確定的剪切應(yīng)力振幅，在這個(gè)振幅上，G"開(kāi)始超過(guò)G'。表明在這種應(yīng)力下，材料開(kāi)始表現(xiàn)得像流體而不是固體。另一方面，恢復(fù)試驗(yàn)表明，在每個(gè)檢查的時(shí)間點(diǎn)、Hep3Gel和對(duì)照材料都能或多或少地逐步恢復(fù)其原有的粘彈性能。

4. 打印參數(shù)優(yōu)化與交聯(lián)動(dòng)力學(xué)關(guān)系

圖4 用22G圓柱形針進(jìn)行的可打印性分析

最小擠出壓力，定義為沸點(diǎn)的長(zhǎng)絲可以連續(xù)擠出的最小壓力，Hep3Gel和對(duì)照材料都有類(lèi)似的隨時(shí)間變化的趨勢(shì)。然而，雖然GEL和ALG顯示出相似的數(shù)值，開(kāi)始交聯(lián)后，Hep3Gel在早期階段的最低擠出壓力較低、并逐漸變得與對(duì)照組的壓力更相似。形狀保真度結(jié)果的多參數(shù)分析表明，對(duì)于所研究的應(yīng)用，可打印性系數(shù)P逐漸接近對(duì)照組。從交聯(lián)開(kāi)始的24小時(shí)后，與單位值的差異達(dá)到最小。并且可打印性的值和孔隙系數(shù)之間有定性的聯(lián)系�；�于這些結(jié)果，打印所檢查尖頭的最佳時(shí)間點(diǎn)是從交聯(lián)開(kāi)始的24小時(shí)。有可能為每種材料確定最有效的噴頭速度和擠壓壓力組合。無(wú)論是圓柱形還是錐形配置。使用22G針頭打印時(shí)獲得的數(shù)據(jù)顯示圓柱形和錐形針在最小擠出壓力方面的一致差異。

5. 通過(guò)外部凝膠化使打印出的構(gòu)建體穩(wěn)定

圖5 打印后流變性能和后處理流程

接著進(jìn)行流變分析以了解擠壓過(guò)程是否以及如何損害尖頭的粘彈性能。在打印之后，所有材料粘彈性能最多下降25%。盡管如此，彈性模量G'仍然高于粘性模量G"，表明材料在擠壓過(guò)程中受到的沖擊并沒(méi)有導(dǎo)致它們從凝膠階段過(guò)渡到溶膠階段。此外，在這個(gè)時(shí)間點(diǎn)上，打印出來(lái)的構(gòu)建體很脆弱，不可能在不損壞的情況下處理。構(gòu)建體制造45分鐘后進(jìn)行的測(cè)試表明，原始的流變特性得到了恢復(fù)、從而重申了Hep3Gel和對(duì)照組水凝膠的自我修復(fù)行為。在這個(gè)時(shí)間點(diǎn)，打印的構(gòu)建體可以更容易處理，而不會(huì)斷裂。然而，由于這種延遲可能會(huì)影響嵌入細(xì)胞的存活。通過(guò)研究不同濃度CaCI2溶液的影響，目的是為了彌補(bǔ)這種在粘彈性能方面的暫時(shí)差距。在不同濃度的CaCI2中，發(fā)現(xiàn)0.1%的CaCI2和0.5%的CaCI2都可以使用。這個(gè)過(guò)程并沒(méi)有導(dǎo)致打印結(jié)構(gòu)收縮，其形狀在培養(yǎng)條件下保持穩(wěn)定達(dá)12天之久，與形狀和孔隙度的尺寸沒(méi)有明顯的差異。

6. 裝有HepG2細(xì)胞生物打印構(gòu)建體靜態(tài)培養(yǎng)狀態(tài)

圖6 HepG2細(xì)胞生物活性狀態(tài)分析

用Hep3Gel制作的構(gòu)建體，定量分析發(fā)現(xiàn)有活力的細(xì)胞顯著增加。從第6天開(kāi)始，細(xì)胞開(kāi)始持續(xù)增長(zhǎng)，在第12天超過(guò)200%的存活率。這一趨勢(shì)在對(duì)照材料中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞活力在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中基本保持不變。在Hep3Gel的情況下，從最初時(shí)間點(diǎn)到最后的時(shí)間點(diǎn)都可以觀察到綠色熒光強(qiáng)度的增加。對(duì)照材料則沒(méi)有觀察到這種增加。無(wú)論是在Hep3Gel還是在控制材料中，紅色熒光強(qiáng)度均沒(méi)有增加。

7. 總結(jié)與展望

內(nèi)部凝膠化是一種優(yōu)異的方法，可以克服兩個(gè)基于擠壓海藻酸鹽生物打印的主要問(wèn)題。首先，打印出來(lái)的支架最終粘彈性能是完全可控的，并且可以進(jìn)行微調(diào)。也避免了不希望和不可控的交聯(lián)梯度形成。此外，這種方法還可以制造自立結(jié)構(gòu)、不需要將海藻酸鹽與其他材料混合，以提高結(jié)構(gòu)的完整性。本文提出了一種直接的方法來(lái)優(yōu)化這種類(lèi)型的生物墨水打印能力。證明Hep3Gel和控制材料不適合于反應(yīng)性生物打印。所提出的方法適合于優(yōu)化打印參數(shù)，以制造所設(shè)計(jì)的構(gòu)造。可允許打印14層自立結(jié)構(gòu)，并且保持預(yù)先確定的粘彈性能。采用大孔3D生物打印的幾何形狀導(dǎo)致更高和均勻的氧合水平、甚至在構(gòu)建體的核心區(qū)域。與在均勻水凝膠上進(jìn)行的研究相比，這使得我們的培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)了50%。進(jìn)一步的研究應(yīng)該集中在采用這個(gè)過(guò)程制造和培養(yǎng)構(gòu)建物，嵌入更多的代謝相關(guān)細(xì)胞類(lèi)型對(duì)本文提出的模型進(jìn)行驗(yàn)證。

文章來(lái)源：
https://iopscience.iop.org/article/10.1088/1758-5090/acd872