韓國(guó)首爾科技大學(xué)：大面積、復(fù)雜組織支架生物3D打印最新成果！

來(lái)源： EngineeringForLife

在制造大面積和復(fù)雜組織工程支架時(shí)，水凝膠原位3D生物打印而不使用有毒交聯(lián)劑是最佳選擇，可以使強(qiáng)生物相容性的強(qiáng)化劑加強(qiáng)和均勻分布。近日，來(lái)自韓國(guó)首爾科技大學(xué)的Insup Noh教授團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了先進(jìn)便攜式生物筆原位均勻混合藻酸鹽-殼聚糖-高嶺土生物墨水進(jìn)行復(fù)雜組織支架3D生物打印的相關(guān)研究。研究成果以“3D bioprinting of complex tissue scaffolds with in situ homogeneously mixed alginate-chitosan-kaolin bioink using advanced portable biopen”為題于5月29日發(fā)表在《Carbohydrate Polymers》上。

圖1 用于組織再生大面積均勻生物墨水沉積生物筆擠壓與滾筒式附件示意圖

本文通過(guò)先進(jìn)筆式擠出機(jī)對(duì)基于海藻酸鹽（AL）-殼聚糖（CH）和高嶺土的多組分生物墨水進(jìn)行了均勻混合和3D生物打印，確保大面積組織重建過(guò)程中的結(jié)構(gòu)和生物均勻性。由于聚合物-高嶺土納米粘土氫鍵和交聯(lián)的鈣離子量較少，AL-CH生物印跡樣品的靜態(tài)、動(dòng)態(tài)和循環(huán)機(jī)械性能以及原位自立打印能力隨著高嶺土濃度的增加而明顯改善。與傳統(tǒng)的混合過(guò)程相比，生物工作筆確保了高嶺土分散的AL-CH水凝膠有更好的混合效果。在大面積多層3D生物打印過(guò)程中引入的兩個(gè)不同的細(xì)胞系（成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞）證實(shí)這種多組分生物匯在體外甚至組織再生中的適用性。高嶺土在整個(gè)生物打印凝膠基質(zhì)中促進(jìn)細(xì)胞均勻生長(zhǎng)和增殖的效果對(duì)于先進(jìn)的筆型擠出機(jī)處理的樣品來(lái)說(shuō)更為顯著。

1. 高嶺土強(qiáng)化水凝膠

圖2 高嶺土納米粘土相關(guān)檢測(cè)

TEM圖像中可以看到1:1層狀鋁硅酸鹽的六邊形板狀結(jié)構(gòu)。SAED圖案顯示了其結(jié)晶結(jié)構(gòu)，大多數(shù)高嶺土納米粘土顆粒的直徑為200-500nm。能量分散X射線光譜（EDS）中可以發(fā)現(xiàn)鋁和硅的存在。擠壓和干燥的AL-CH-NC 0和AL-CH-NC 4樣品表面形態(tài)存在孔隙和不規(guī)則，有助于細(xì)胞的附著和生長(zhǎng)。水凝膠表面的高嶺土含量很低，在XRD中，10°和20°左右觀察到CH的特征峰。與高嶺土對(duì)應(yīng)的X射線衍射（XRD）峰相匹配。XRD分析可以確定材料中存在的結(jié)晶相，并揭示其化學(xué)成分。海藻酸鹽-殼聚糖水凝膠的形成打破了海藻酸鹽中的羥基和殼聚糖中的氨基之間的氫鍵，主要由于其在AL-CH組合水凝膠中的無(wú)定形結(jié)構(gòu)所導(dǎo)致。在AL-CH-NC 4中，12.5°和25°處的高嶺土峰證實(shí)了高嶺土的存在。原材料和制備的樣品的FT-IR結(jié)果顯示顯示，由于甲殼素的部分脫乙�；�，在2873 cm-1處出現(xiàn)了殼聚糖的酰胺峰強(qiáng)度。在AL-CH-NC 4中，在1649 cm-1左右觀察到海藻酸的特征峰對(duì)應(yīng)于-COOH基團(tuán)。在AL-CH-NC 4樣品中，3664 cm-1（-OH振動(dòng)）和1107 cm-1（Si-O拉伸）附近的峰證實(shí)了高嶺土的存在。

2. 流變學(xué)和抗壓機(jī)械性能及用于3D生物打印循環(huán)抗壓和機(jī)械紋理特性

圖3 高嶺土納米粘土與海藻酸鹽/殼聚糖水凝膠的流變學(xué)和壓縮機(jī)械性能

沒(méi)有高嶺土加固的樣品膨脹程度明顯高于高嶺土加固的樣品，隨著高嶺土的增加，腫脹程度降低。在第2天，未加固的樣品的膨脹仍在繼續(xù)，而基于高嶺土的樣品的膨脹較小。表明隨著水凝膠中高嶺土含量的增加，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性得到了增強(qiáng)。降解研究顯示高嶺土對(duì)于抑制海藻酸/殼聚糖可擠壓水凝膠的降解速度的必要性，鈣離子交聯(lián)劑的用量很少。第4天后，所有基于高嶺土的樣品的降解率都明顯低于純海藻酸/殼聚糖水凝膠樣品。膨脹和降解研究結(jié)果表明，高嶺土明顯改善了這種水凝膠的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。在壓縮模式測(cè)試中，Biowork筆混合的AL-CH-NC 4水凝膠樣品顯示出比AL-CH-NC 4H水凝膠（常規(guī)混合）更好的結(jié)果。與AL-CH-NC 0相比，AL-CH-NC 4的循環(huán)抗壓強(qiáng)度隨著高嶺土的增加而提高了一倍。傳統(tǒng)混合的樣品（AL-CH-NC 4H）的循環(huán)抗壓強(qiáng)度（0.062 ± 0.002 N）低于生物混合的AL-CH-NC 2（0.073 ± 0.003）。其他與印刷有關(guān)的性能也較差。分層硅酸鹽的硬度促成效果改善，與3D打印相關(guān)的性能，如硬度、膠粘性和咀嚼性，隨著高嶺土納米粘土的加入而明顯提高并呈上升趨勢(shì)。

3. 優(yōu)化Biowork筆工作區(qū)以提高其擠壓能力

圖4 對(duì)AL-CH-NC Biowork筆擠出優(yōu)化

本研究中使用的生物工作筆是首創(chuàng)，因此其工作區(qū)應(yīng)針對(duì)特定的水凝膠進(jìn)行優(yōu)化，以便在擠壓式3D打印/生物打印過(guò)程中獲得連續(xù)和均勻的流速。在擠壓過(guò)程中，在不同的時(shí)間估算流速，以找出不同的螺桿轉(zhuǎn)速下的均勻性。在沒(méi)有任何附著物的情況下，biopen在很寬的螺桿轉(zhuǎn)速范圍內(nèi)顯示出擠壓的均勻性。在30至54轉(zhuǎn)/分的范圍內(nèi)，擠出的均勻性很好。剖面均勻性表明，使用這種針時(shí)，42至54轉(zhuǎn)/分是最合適的。對(duì)于22號(hào)塑料針，可以使用36-54轉(zhuǎn)/分。對(duì)于18至60轉(zhuǎn)/分的區(qū)域，r2值達(dá)到了0.966。在不同轉(zhuǎn)速下研究的三個(gè)擠壓部分或區(qū)段中，區(qū)段均勻性非常高。在18到30的范圍內(nèi)，流速與轉(zhuǎn)速的相關(guān)性為0.965，然而在更高的轉(zhuǎn)速下，流速的相關(guān)性并不理想。在較高的轉(zhuǎn)速下，輥頭中積累的凝膠量較高，可能會(huì)引起沉積的不規(guī)則性。因此，對(duì)于3D打印和生物打印，當(dāng)輥頭用于水凝膠或生物墨水的大面積多層沉積時(shí)，選擇24rpm。

4. 使用Biowork筆對(duì)多成分納米復(fù)合生物墨水進(jìn)行大面積3D打印時(shí)均勻性研究

圖5 不同放大倍數(shù)3D打印凍干樣品的SEM圖像

凍干納米復(fù)合凝膠樣品的表面形態(tài)和EDS圖譜顯示這些樣品使用固定在三維生物打印機(jī)中輥頭連接的Biopork擠出頭用于大面積3D打印。對(duì)于AL-CH-NC 4H樣品，使用連接到設(shè)計(jì)輥頭的注射器擠出凝膠。高嶺土納米粘土的使用對(duì)交聯(lián)凝膠結(jié)構(gòu)中的孔隙大小及其分布有重大影響。在傳統(tǒng)的混合樣品中，結(jié)構(gòu)的不規(guī)則性在其低倍率圖像中很明顯的。在打印結(jié)構(gòu)的不同部分，在高倍鏡下可以觀察到高多孔結(jié)構(gòu)的不規(guī)則性。礬（Al）和硅（Si）的EDS圖顯示了納米復(fù)合凝膠樣品表面的納米粘土的分布。在打印AL-CH-NC 0時(shí)，觀察到高嶺土納米粘土的作用，它在較低高度上是扭曲的。與傳統(tǒng)混合方式相比，使用這種生物粘合劑加工所需時(shí)間大大減少。流動(dòng)模擬研究顯示與傳統(tǒng)的磁力攪拌器混合過(guò)程相比，biopen系統(tǒng)的混合效果更好。對(duì)于粘稠的凝膠材料，磁力攪拌器不能有效地混合位于中心區(qū)域的顆粒，而B(niǎo)iopen中的逆向旋轉(zhuǎn)螺桿段由于在桶內(nèi)任何點(diǎn)速度隨時(shí)間變化，可以較容易混合各組分。通過(guò)增加凝膠中的高嶺土含量，可以進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)高度精度。以上結(jié)果證明使用這種先進(jìn)的biopen擠出頭進(jìn)行納米復(fù)合材料或多組分水凝膠的三維生物打印的顯著優(yōu)勢(shì)。

5. 基于海藻酸/殼聚糖/高嶺土多組份納米復(fù)合生物墨水使用Biowork筆進(jìn)行大面積3D生物打印

圖6 使用MC3T3成骨細(xì)胞進(jìn)行biopen處理大面積3D生物打印樣品MTT檢測(cè)

對(duì)于該體系接著使用MC3T3小鼠成骨細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，MTT檢測(cè)結(jié)果顯示所有樣品都顯示100%細(xì)胞存活率，表明這些納米復(fù)合水凝膠具有細(xì)胞支持性和無(wú)毒的性質(zhì)。樣品細(xì)胞存活率隨著天數(shù)的增加而增加。本研究中使用的生物墨水生物相容性強(qiáng)成分交聯(lián)。用于溶解殼聚糖的醋酸量非常少。第0天的活/死結(jié)果表明活細(xì)胞在整個(gè)凝膠基質(zhì)中均勻分布。7天的研究證實(shí)了這些水凝膠的細(xì)胞支持性。使用輥頭連接的biopen進(jìn)行三維生物打印結(jié)構(gòu)表明細(xì)胞在水凝膠基質(zhì)中的均勻生長(zhǎng)和增殖。在7天內(nèi)，細(xì)胞增殖并幾乎覆蓋了整個(gè)凝膠結(jié)構(gòu)。高嶺土對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖有明顯的影響，從納米復(fù)合水凝膠的細(xì)胞密度隨著高嶺土濃度的增加而逐漸增加可以看出。在MTT試驗(yàn)中觀察到的最初的細(xì)胞生長(zhǎng)遲緩（直到第3天）的結(jié)果可能是由于水凝膠中細(xì)胞粘附性較差并主要成分缺乏粘附點(diǎn)，以及對(duì)新環(huán)境的適應(yīng)問(wèn)題。細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖隨著高嶺土含量的增加而明顯改善，H&E和MT染色也證實(shí)隨著多成分生物墨水中高嶺土濃度的增加，細(xì)胞外基質(zhì)形成。在MT染色的樣品中，e3和f3樣品中分泌的膠質(zhì)（綠色）數(shù)量較高，表明在較高的高嶺土納米粘土數(shù)量下，可能會(huì)形成骨組織，結(jié)構(gòu)變硬。所有的結(jié)果表明，高嶺土納米凝膠對(duì)生物墨水打印支架的體外組織再生的影響。



6. 總結(jié)與展望

大面積組織工程支架制造需要在每個(gè)三維生物打印層中都具有均勻細(xì)胞分布和均勻生物力學(xué)特性，模仿天然組織，如大面積皮膚、復(fù)雜的軟骨、分叉的血管等。控制每一層的組合，特別是與3D生物打印中細(xì)胞的組合，導(dǎo)致其最終的機(jī)械和生物特性。本文開(kāi)發(fā)了一種含有高嶺土的多組份納米復(fù)合藻酸鹽-殼聚糖水凝膠生物墨水，使用新的先進(jìn)生物打印頭確保細(xì)胞在生物墨水中均勻分布。這種具有均勻分布的殼聚糖和高嶺土納米粘土的多組分藻酸鹽水凝膠通過(guò)生物墨水網(wǎng)絡(luò)中的聚電解質(zhì)復(fù)合、氫鍵和離子交聯(lián)的均勻分布實(shí)現(xiàn)卓越結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。隨著高嶺土含量的增加，海藻酸鹽/殼聚糖水凝膠的機(jī)械、生物（體外）和三維擠壓生物打印性能得到增強(qiáng)�；�于雙螺桿筆型設(shè)備的便攜性確保了它可以作為先進(jìn)的擠出頭（手持式或固定式）用于重建組織工程，而生物墨水與該設(shè)備的相結(jié)合，更加促進(jìn)皮膚組織重建的應(yīng)用。未來(lái)在大面積多層用于深層傷口重建體內(nèi)皮膚組織工程中該體系將會(huì)有更大的發(fā)展。



文章來(lái)源：

https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2023.121046