《Biofabrication》：熱噴墨生物打印顯著改變細(xì)胞表型

來源： EngineeringForLife

細(xì)胞噴墨生物打印，全稱為三維細(xì)胞打印技術(shù)，是一種利用數(shù)字控制的噴墨技術(shù)，將細(xì)胞、生物材料和生長因子等組成部分精確地排列在生物基質(zhì)上，生成三維生物結(jié)構(gòu)的生物醫(yī)學(xué)技術(shù)。該技術(shù)于2003年首次被開發(fā)出來，并逐漸得到廣泛應(yīng)用。細(xì)胞噴墨生物打印的工作原理類似于普通的噴墨打印，但使用的液體不是油墨，而是由細(xì)胞、生物材料和生長因子等組成的生物水溶液。這些水溶液錯層地依次加注入噴頭中，并且通過高頻振動或氣體壓縮來噴出微小的液滴。然后，這些液滴可以準(zhǔn)確地落在預(yù)設(shè)的位置上，建立所需的三維生物結(jié)構(gòu)，最終形成具有特定功能的人工組織、器官或外皮層。

相比于傳統(tǒng)的二維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，細(xì)胞噴墨生物打印可以創(chuàng)造出具有更高密度和更真實感的細(xì)胞模型，具有更好的仿真性和可重復(fù)性。同時，這種技術(shù)還可以直接將大量的細(xì)胞植入到缺陷組織中進(jìn)行修復(fù)和再生，從而避免了傳統(tǒng)醫(yī)療方案中可能存在的移植物排斥反應(yīng)和外科手術(shù)造成的創(chuàng)傷。截至目前，細(xì)胞噴墨生物打印已經(jīng)成功應(yīng)用于許多領(lǐng)域的研究和實踐中。例如，在組織工程領(lǐng)域，該技術(shù)可以用來構(gòu)建人工骨骼、肌肉、血管等各種不同類型的組織；在外科手術(shù)領(lǐng)域，該技術(shù)可以用來為患者進(jìn)行皮膚移植或骨骼修復(fù)等手術(shù)；在藥物研發(fā)領(lǐng)域，該技術(shù)可以用于篩選新藥并評估其治療效果。然而，與其他新興技術(shù)一樣，細(xì)胞噴墨生物打印也面臨著一些挑戰(zhàn)和限制。量化打印機(jī)的輸入和測量打印機(jī)的輸出一直是生物打印領(lǐng)域努力的方向，因為幾乎不可能表征打印孔或內(nèi)部的細(xì)胞擠壓針。

來自美國得克薩斯大學(xué)埃爾帕索分校的Thomas Boland團(tuán)隊描述了一些最近因噴墨生物打印而發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞行為。首先，將原代和永生化成人真皮成纖維細(xì)胞在接收后擴(kuò)增 2-3 代，然后收集細(xì)胞，將其重懸于 PBS 中，并使用 pluriSTEM 培養(yǎng)基將其生物打印到 96 孔板中。然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到預(yù)涂的 96 孔板中，或移取 20 μL 液滴進(jìn)行懸滴培養(yǎng)。應(yīng)用 IPC 分化方案并在打印后約 45 分鐘開始誘導(dǎo)。當(dāng)分化聚集體時，起始發(fā)生在聚集體轉(zhuǎn)移到 96 孔板中，在 45 分鐘后標(biāo)準(zhǔn)免疫染色和 RNA-Seq 分析細(xì)胞表型。初步結(jié)果表明所有細(xì)胞都表達(dá)了三種多能性標(biāo)記 oct-4、nanog 和 sox-2。應(yīng)用心肌細(xì)胞分化方案后，細(xì)胞的肌鈣蛋白 3 染色呈陽性。細(xì)胞也伸長并且在形態(tài)上變得更像心肌細(xì)胞。本研究分析了大量 RNA 序列數(shù)據(jù)，本研究的初步結(jié)果顯示一些與干細(xì)胞標(biāo)記有關(guān)的基因上調(diào)：EPCAM、LEFTY1、ZFP42 和 TEX19。此外，與多能性相關(guān)通路相關(guān)的基因的差異表達(dá)表明，一些通路已關(guān)閉，如預(yù)期多能狀態(tài)的 MAPK/p38、MAPK/JNK1-3。本研究也有數(shù)據(jù)支持通過 TAZ 高度上調(diào)和 YAP 染色細(xì)胞體激活河馬途徑。此外，GSK3B 處于關(guān)閉狀態(tài)，TGFB1、LIF/PIK3 和 AKT1 處于多能性預(yù)期狀態(tài)。檢查上調(diào)基因的基因網(wǎng)絡(luò)，可以清楚地區(qū)分與多能性相關(guān)的 FOS、FOXO1 和 PIK3 的關(guān)鍵作用。生物打印的成纖維細(xì)胞至少會暫時采用更原始或去分化的狀態(tài)，這讓人聯(lián)想到多能性。雖然免疫化學(xué)顯示了多能性所需的經(jīng)典轉(zhuǎn)錄因子，但基因表達(dá)顯示了印刷時發(fā)生的轉(zhuǎn)化的更微妙的畫面。了解這些轉(zhuǎn)變，即使是暫時的，在嘗試使用生物打印技術(shù)構(gòu)建組織時也至關(guān)重要。相關(guān)工作以題為“Thermal inkjet bioprinting drastically alters cell phenotype”的文章發(fā)表在2023年5月9日的國際著名期刊《Biofabrication》。

1. 創(chuàng)新型研究內(nèi)容

圖 1 展示了打印后 24 小時 TIB 成纖維細(xì)胞的抗體染色，標(biāo)記有針對 OCT-4（綠色）、Sox2（紅色）和 Nanog（紅色）的熒光標(biāo)記初級單克隆抗體。未打印但接受相同處理的對照細(xì)胞也顯示在圖中并且未顯示任何染色。還展示了通過懸滴法形成并用三種抗體染色的細(xì)胞聚集體的染色。類似于鋪板細(xì)胞的圖像，OCT-4 在所有細(xì)胞中表達(dá)，但轉(zhuǎn)錄因子 Nanog 似乎并未在所有細(xì)胞中表達(dá)，而是集中在聚集體的內(nèi)部質(zhì)量上。雖然 Sox-2 存在于所有鋪板細(xì)胞中，但它在 2 日齡聚集體中的表達(dá)似乎低于新打印細(xì)胞中的表達(dá)。初步結(jié)果表明所有細(xì)胞都表達(dá)了三種多能性標(biāo)記 oct-4、nanog 和 sox-2。應(yīng)用心肌細(xì)胞分化方案后，細(xì)胞的肌鈣蛋白 3 染色呈陽性。細(xì)胞也伸長并且在形態(tài)上變得更像心肌細(xì)胞。本研究分析了大量 RNA 序列數(shù)據(jù)，本研究的初步結(jié)果顯示一些與干細(xì)胞標(biāo)記有關(guān)的基因上調(diào)：EPCAM、LEFTY1、ZFP42 和 TEX19。此外，與多能性相關(guān)通路相關(guān)的基因的差異表達(dá)表明，一些通路已關(guān)閉，如預(yù)期多能狀態(tài)的 MAPK/p38、MAPK/JNK1-3。本研究有數(shù)據(jù)支持通過 TAZ 高度上調(diào)和 YAP 染色細(xì)胞體激活河馬途徑。此外，GSK3B 處于關(guān)閉狀態(tài)，TGFB1、LIF/PIK3 和 AKT1 處于多能性預(yù)期狀態(tài)。通過檢查上調(diào)基因的基因網(wǎng)絡(luò)，可以清楚地區(qū)分與多能性相關(guān)的 FOS、FOXO1 和 PIK3 的關(guān)鍵作用。

圖1 共聚焦顯微鏡圖像顯示 OCT-4、Sox-2 和 Nanog 蛋白以及 DAPI 的染色

圖 2 展示了打印后立即接受心肌細(xì)胞分化方案的 TIB 成纖維細(xì)胞，該細(xì)胞用標(biāo)有 Alexa Fluor 647 的初級肌鈣蛋白 I 型 3（心臟）抗體染色。含有鍍層成纖維細(xì)胞的對照樣品進(jìn)行了相同的分化和染色工藝，但未進(jìn)行生物打印，結(jié)果表明其未顯示任何染色。大多數(shù) TIB 細(xì)胞顯示出細(xì)長的矩形細(xì)胞形態(tài)，并且肌鈣蛋白 I 呈陽性，比對照細(xì)胞長得多。細(xì)胞似乎沿著一個共同的軸伸長，并且在一些圖像中可以看到它們相互作用或相互連接。據(jù)本研究所知，這是第一次報告這種細(xì)胞狀態(tài)，本研究稱之為應(yīng)變誘導(dǎo)的臨時自動啟動重編程或 SITAR。在本研究的觀察中，這種重新編程是暫時的，并且隨著時間的推移，三個標(biāo)記的表達(dá)水平會降低。這可以通過比較 3 至 4 天的聚集體中 Sox-2 或 Nanog 的染色與這些因子在鍍層的新鮮印刷細(xì)胞中的染色來理解。然而，經(jīng)過多能干細(xì)胞合格培養(yǎng)一周后，仍然可以觀察到一些染色。盡管如此，它仍然只出現(xiàn)在細(xì)胞體的下部，或者可能與細(xì)胞外基質(zhì)凝膠結(jié)合，細(xì)胞被接種在凝膠上。SITAR 狀態(tài)的臨時性質(zhì)也可以解釋生物打印文獻(xiàn)中缺乏報告的原因，即使生物打印已成為許多實驗室廣泛使用的工具。大多數(shù)團(tuán)隊會在生物打印后添加特定的介質(zhì)，這種介質(zhì)已被開發(fā)用于維持分化的細(xì)胞。本研究假設(shè)這些介質(zhì)加速從 SITAR 狀態(tài)重新分化為原始細(xì)胞類型。

圖2 打印后立即接受心肌細(xì)胞分化方案的 TIB 成纖維細(xì)胞

為了開始了解這一發(fā)現(xiàn)的起源，本研究進(jìn)行了許多基本實驗。圖 3A 展示打印后 3 小時的 TIB 細(xì)胞 YAP（紅色）α-微管蛋白（綠色）和細(xì)胞核（藍(lán)色）染色，而圖 3B 顯示打印后 24 小時的細(xì)胞。據(jù)推測，使用熱噴墨打印機(jī)時提供給電池的熱量可能會導(dǎo)致 SITAR。通過手動將細(xì)胞噴射通過打印頭中的孔來排除這種熱沖擊，沒有提供外部電源并且仍然觀察到正在表達(dá)的三種多能標(biāo)記。然而，當(dāng)將打印頭浸入培養(yǎng)基中時手動迫使細(xì)胞懸浮液通過孔口時，不會觀察到 SITAR。因此進(jìn)一步排除了細(xì)胞通過 80 um 孔時所經(jīng)歷的剪切可以解釋該現(xiàn)象。因此，本研究目前的解釋是，細(xì)胞周圍小液滴的形成是導(dǎo)致去分化的觸發(fā)事件。本研究打印設(shè)置中的液滴大小約為 80 pl，液滴從孔板中出來時有很長很細(xì)的尾巴。在這些液滴中，細(xì)胞膜在幾分之一秒內(nèi)被拉伸和壓縮，這種應(yīng)變的突然變化被轉(zhuǎn)化為細(xì)胞核，在那里開始表達(dá)更原始或原始的基因。然而，在這一點上，本研究沒有這方面的證據(jù)，本研究只是報告 TIB 后 24 小時到幾天后的細(xì)胞狀態(tài)。

圖3 打印后 3 小時 (A) 和 24 小時 (B) 后表達(dá) YAP（紅色）和 Alpha 微管蛋白（綠色）的 TIB 成纖維細(xì)胞

圖 4 顯示了打印后 2 小時和 12 小時與多能性相關(guān)通路相關(guān)的基因的差異表達(dá)。已顯示下調(diào)和上調(diào)的基因分別以紅色和綠色顯示。圖 5 則顯示了印后 12 小時 TIB 細(xì)胞顯著上調(diào)基因的基因網(wǎng)絡(luò)。還應(yīng)注意，TIB 樣本中的所有細(xì)胞都表達(dá) OCT-4，大多數(shù)細(xì)胞表達(dá) Sox-2，并且 Nanog 染色的細(xì)胞略少。雖然更傳統(tǒng)的多能干細(xì)胞生成方法是高度手動的，需要手工挑選用于培養(yǎng)的細(xì)胞很少，但 TIB 方法是自動化的，不需要人工干預(yù)，這對于稱為全自動系統(tǒng)的某些應(yīng)用程序可能是一個優(yōu)勢，例如用于大批量制造。由于 SITAR 狀態(tài)的短暫性，本研究沒有觀察到干細(xì)胞樣特征在細(xì)胞分裂后傳遞給子細(xì)胞。目前本研究還不知道培養(yǎng)物是否可以繁殖。TIB 細(xì)胞可以在打印后立即冷凍保存，方法是將 10% DMSO 添加到打印細(xì)胞的小瓶中的介質(zhì)中，并以每分鐘 1C 的速度緩慢冷卻。在冷凍保存和解凍實驗中，按照標(biāo)準(zhǔn)方案去除冷凍保護(hù)劑，細(xì)胞對測試的三種標(biāo)記物仍然呈陽性。

圖4 多能性相關(guān)通路相關(guān)基因的差異表達(dá)

據(jù)本研究目前所知，SITAR 細(xì)胞并不是真正的多能細(xì)胞。例如，即使表達(dá)了指示多能性的標(biāo)記，在植入 TIB 細(xì)胞的十年研究中，本研究也從未在動物身上看到過畸胎瘤的形成。然而，最近植入 SITAR 細(xì)胞聚集體的初步實驗可能在植入 4 周后顯示未成熟的畸胎瘤；這些發(fā)現(xiàn)需要在更長的植入時間內(nèi)重復(fù)。這與似乎沒有集落形成和將特征傳遞給子細(xì)胞一起，向我們表明 SITAR 細(xì)胞的狀態(tài)是短暫和不穩(wěn)定的，但可以通過在生物打印后允許細(xì)胞聚集來延長。

圖5 12小時顯著上調(diào)的基因網(wǎng)絡(luò)圖

2. 總結(jié)與展望
本研究發(fā)現(xiàn)成年原代成纖維細(xì)胞在 80 pl 液滴內(nèi)拉伸時至少會暫時采用更原始或去分化的狀態(tài)，這讓人聯(lián)想到多能性。多能性細(xì)胞可以分化成心臟譜系等。這種稱之為 SITAR 的現(xiàn)象被認(rèn)為發(fā)生在所有經(jīng)歷應(yīng)變的細(xì)胞中，進(jìn)一步探索 SITAR 狀態(tài)可能會導(dǎo)致利用內(nèi)在潛力和再生醫(yī)學(xué)的新了解。

文章來源：https://iopscience.iop.org/article/10.1088/1758-5090/acd3b3