實現(xiàn)3D膠原蛋白器官支架的高分辨率打印

來源： EngineeringForLife

基于微凝膠的支撐浴中的3D打印能夠使用柔軟和水狀的生物材料構建復雜的結構，但低打印分辨率通常是其在組織工程中實際應用的障礙。近日，來自大阪大學的Michiya Matsusaki團隊通過使用含有檸檬酸三鈉（TSC）的工程蓋蘭膠（GG）微凝膠浴實現(xiàn)3D膠原蛋白器官支架的高分辨率打印。將TSC引入浴液系統(tǒng)不僅減輕了GG微凝膠的聚集，導致更均勻的浴形態(tài)，而且由于TSC的脫水作用，還抑制了膠原墨水在浴中的擴散，這兩者都有助于提高打印分辨率。這項工作為開發(fā)用于高分辨率打印膠原蛋白的微凝膠浴提供了一種易于操作的策略，為體外3D器官構建提供了另一種途徑。相關論文“3D printing of collagen scaffold with enhanced resolution in a citrate-modulated Gellan gum microgel bath”于2023年5月5日在線發(fā)表于雜志《Advanced Healthcare Materials》上。

在微凝膠浴中進行3D打印，可以用柔軟且含水的生物材料打印復雜的結構。如圖1（a）所示，GG微凝膠浴支持注射印刷，通過噴嘴在浴中的程序化移動，連續(xù)擠出膠原油墨以制造設計圖案。印刷過程中，微凝膠為墨水提供了機械支撐和固定，避免了印刷結構在重力作用下的變形，如圖1（b）所示。GG微凝膠浴是通過將本體凝膠機械研磨成微凝膠片來制備的。如圖1（c）所示，通過該方法獲得的GG微凝膠通常具有大的粒徑和多分散性，因為小的微凝膠由于氫鍵或離子相互作用而聚集，這不可避免地導致在該浴中印刷精度低。此外，流體膠原油墨在微凝膠之間的大間隙和空隙中的擴散將導致印刷細絲的直徑更大和形態(tài)更不規(guī)則。為了克服這個問題，本工作開發(fā)了一種易于操作但有效的策略，基于Hofmeister效應調節(jié)GG微凝膠浴，如圖1（d）所示。通過簡單地將合適的鹽引入浴中，可以同時實現(xiàn)小而均勻的微凝膠和抑制的墨水擴散，從而在新的GG微凝膠浴中可以實現(xiàn)提高的打印分辨率。

圖1 微凝膠打印過程和打印產品的方案

然后，研究者通過簡單的工藝制備了新版GG微凝膠浴（圖2（a））。GG本體凝膠之前是通過在100 °C下將GG粉末溶解在PBS中，然后在室溫下通過與鈉離子形成螺旋結構進行凝膠化來制備的（圖2（b））。在浴中添加TSC導致均勻的微凝膠形態(tài)，顆粒尺寸顯著減�。▓D2（c-e））。如圖2（f）所示，由于其脫水行為，TSC的引入可能會降低GG分子在凝膠中的溶解度，并導致GG微凝膠的相分離，最終降低微凝膠之間表面的相互作用位點。因此，TSC的加入促進了微凝膠的分散。

圖2 GG-TSC微凝膠浴的制備工藝和表征

為了揭示TSC對墨水凝膠化速度的影響，如圖3（a-b）所示，膠原溶液在凝膠化之前是透明的，但一旦凝膠化就會變成白色和不透明的，因此墨水的顏色變化可以用作監(jiān)測注入浴中后凝膠化過程的信號。通過測量墨絲的相對灰度值來量化墨水顏色隨時間的變化。圖3（c）顯示了不同浴中墨水的歸一化灰度值變化的比較，這表明TSC的添加導致膠原墨水的凝膠化速度更快。較快的凝膠化可歸因于TSC對蛋白質（即膠原油墨）的鹽析效應。完全凝膠化所需的時間如圖3（d）所示。

圖3 在浴中印刷膠原的凝膠化表征

為了證明TSC對打印分辨率的影響，在添加和不添加TSC的浴中打印膠原絲，并通過比較在一系列噴嘴移動速度下打印的絲的平均直徑來評估分辨率。如圖4（a和b）所示，在含有TSC的浴中打印的所有膠原線都顯示出具有不同邊界的完整形狀。為了確定印刷的最佳TSC濃度，在具有不同TSC濃度的浴中印刷網狀結構（圖4（c））。如圖4（d）所示，盡管所有浴都可以打印出完整的網狀結構，但打印細節(jié)在兩個細絲交叉區(qū)域的細絲直徑和位移方面有所不同。圖4（e）顯示了網狀結構中細絲平均直徑的比較。結果表明，隨著TSC濃度的增加，細絲直徑減小。

圖4 膠原油墨在有或沒有TSC的浴中印刷的相關表征

如圖5（a）所示，通過使用開發(fā)的GG-TSC微凝膠浴，可以成功印刷復雜的器官結構。由于GG微凝膠和膠原油墨之間的化學差異，印刷樣品可以通過浸入乙醇/水（體積為1:1）中的0.5v/v%GA溶液中，在浴中直接交聯(lián)。圖5（b-l）顯示了在開發(fā)的GG-TSC浴系統(tǒng)中打印的人耳模型、手、全尺寸人類心臟瓣膜等結構（圖5），證明了微凝膠浴的良好打印性。如圖5（l）所示，兩種色素在節(jié)段區(qū)域沒有任何融合的情況下被分配，這表明膠原模型內部具有良好的結構完整性。高打印分辨率使得通過3D打印技術復制功能器官成為可能。

圖5 3D模型和相應的打印膠原蛋白產品

由于TSC是一種常見的水溶性食用食品添加劑，它可以很容易地通過水洗去除。經洗滌和滅菌后，獲得的膠原樣品可用于與細胞共培養(yǎng)，用于組織工程。如圖6（a）所示，將HiPS CM細胞與膠原片共培養(yǎng)，活/死細胞染色顯示，細胞以非常高的活力（超過95%）緊密地分布在膠原片的表面上，這表明印刷產品具有良好的細胞兼容性（圖6（b））。在膠原上培養(yǎng)HiPS CM細胞7天后，膠原片表現(xiàn)出強烈的跳動行為（圖6（c））。圖6（d）顯示了頻率為48 bpm的心臟跳動的代表圖。HiPS-CM細胞的協(xié)同收縮表明單個細胞彼此之間具有良好的通信。如圖6（e）所示，H&e染色表明，HiPS-CM均勻地分布在膠原片的表面上，并緊密地相互附著，在片上形成細胞層。細胞層的協(xié)同搏動有助于整體收縮力，并使整個膠原片能夠普遍運動。

圖6 生物毒性測試

綜上，本文開發(fā)了一種基于Hofmeister效應的易于操作的策略，以調節(jié)GG微凝膠，用于膠原器官支架的高分辨率3D打印。在浴中引入TSC不僅防止了GG微凝膠的聚集，導致微凝膠在浴中的平均粒徑減小和良好的分散狀態(tài)，而且通過鹽析效應加速凝膠化來抑制墨水擴散，這兩者都有助于提高GG浴中的打印分辨率。通過使用新一代GG微凝膠浴，可以高保真地打印包括手、耳朵甚至心臟結構在內的復雜生物結構。此外，TSC可以很容易地通過洗滌去除，因此印刷產品表現(xiàn)出良好的生物相容性。這項工作提供了一種簡單的策略來調節(jié)GG微凝膠以高分辨率打印膠原蛋白，為組織工程和醫(yī)學應用的體外器官構建提供了一條替代途徑。



文章來源：

https://doi.org/10.1002/adhm.202301090