3D打印動態(tài)多器官芯片！為2型糖尿病研究打下基礎(chǔ)

來源：EngineeringForLife  

2型糖尿�。═2D）是一種高發(fā)病率的慢性復(fù)雜疾病，對各種器官造成嚴(yán)重?fù)p害。T2D有許多病因尚未被完全闡明。盡管已經(jīng)建立了各種模型來了解T2D，但重建T2D的組織特異性微環(huán)境和并發(fā)癥仍然十分困難。近日，來自韓國浦項科技大學(xué)的Dong-Woo Cho、韓國天主教大學(xué)的Jae Yon Won教授團(tuán)隊進(jìn)行了3D細(xì)胞打印進(jìn)行2型糖尿病模擬的組織特異性多器官片上病理生理學(xué)重建的相關(guān)研究。研究成果以“Pathophysiological Reconstruction of a Tissue-Specific Multiple-Organ On-A-Chip for Type 2 Diabetes Emulation using 3D Cell Printing”為題于2023年03月09日發(fā)表在《Adv. Funct. Mater.》上。

本文開發(fā)了一個動態(tài)多器官芯片，模擬高血糖環(huán)境下T2D和內(nèi)臟脂肪組織（vAT），使用3D細(xì)胞打印與脫細(xì)胞外基質(zhì)（dECM）。該芯片由與T2D密切相關(guān)的胰腺、脂肪組織和肝臟獨立部分組成，并增加了視網(wǎng)膜以確認(rèn)T2D并發(fā)癥情況。此外，在高血糖環(huán)境下，T2D的病理特征在帶有vAT衍生的dECM生物墨水芯片中清楚揭示。引起了視網(wǎng)膜區(qū)細(xì)胞功能障礙。此外，在芯片上治療T2D藥物顯示出臨床上相同的療效。該芯片適用于再現(xiàn)T2D關(guān)鍵特征，是一個有前途的藥物測試和T2D并發(fā)癥研究平臺。

圖1 對sadECM和vadECM生物匯的評估

通過脫細(xì)胞方法，制備了sadECM和vadECM生物匯。生物匯在4℃時保持流體狀態(tài)，在37℃孵化后表現(xiàn)出熱交聯(lián)行為。對sadECM和vadECM與原生組織進(jìn)行生化評估比較表明脫細(xì)胞過程幾乎沒有留下DNA，但其他細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）成分，如膠原蛋白和糖胺聚糖（GAG）都高度保存。因此，使用脫細(xì)胞工藝制備的生物匯充分去除細(xì)胞成分，并且適合于保持ECM成分。使用人類脂肪來源的干細(xì)胞（hASC）在2%的膠原蛋白、sadECM和vadECM生物墨水中進(jìn)行活/死檢測和細(xì)胞計數(shù)試劑盒（CCK）檢測�；�/死試驗顯示，生物墨水都具有良好的生物相容性。包裹的hASCs在14天內(nèi)保持高活力。特別是，vadECM生物墨水顯示出最高的增殖率。以上結(jié)果證實，使用3D生物打印技術(shù)開發(fā)的結(jié)構(gòu)可以在細(xì)胞存活的情況下進(jìn)行制造，而且預(yù)處理的生物墨水有足夠的物理特性來支持該結(jié)構(gòu)。

圖2 sadECM和vadECM生物匯對脂肪生成分化、細(xì)胞因子分泌和巨噬細(xì)胞活性的影響

在糖尿病病理環(huán)境中，脂肪細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子會吸引激活巨噬細(xì)胞。被激活的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子，增加脂肪組織（AT）慢性炎癥。炎癥狀態(tài)的擴(kuò)大直接影響葡萄糖代謝，增加T2D發(fā)展的可能性。在這方面，本文進(jìn)行了實驗來分析各生物墨水的脂肪細(xì)胞分化能力和巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的趨化因子分泌能力。將hASCs分化為脂肪細(xì)胞后，進(jìn)行油紅O染色，檢查vadECM、sadECM和膠原蛋白生物墨水涂層組脂質(zhì)數(shù)量。與其他組相比，vadECM生物墨水組的脂肪細(xì)胞產(chǎn)生了更多的脂肪生成表型和更多的脂質(zhì)。此外，在vadECM生物墨水組中，細(xì)胞是最大的，因為它們含有最多的脂質(zhì)。白細(xì)胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）在有或沒有巨噬細(xì)胞的vadECM生物墨水組中檢測到最高水平。因此，證明vadECM在產(chǎn)生由細(xì)胞因子分泌誘導(dǎo)的炎癥狀態(tài)方面優(yōu)于sadECM。為了證實生物墨水和巨噬細(xì)胞之間的相關(guān)性，本文進(jìn)行了細(xì)胞遷移試驗。結(jié)果顯示在AT室中有vadECM的組中，巨噬細(xì)胞的遷移最為活躍。以上結(jié)果表明，vadECM支持差異化成脂線和封裝細(xì)胞生存。此外，它還增加細(xì)胞因子的產(chǎn)生，促進(jìn)了免疫細(xì)胞遷移或增殖，與sadECM相比較。使用vadECM可以提高T2D相關(guān)炎癥的進(jìn)展。因此，在T2D芯片上使用vadECM可以可靠地模擬T2D的病理環(huán)境。

圖3 三維細(xì)胞打印的組織特異性多器官片上模型和多器官相互作用的影響

將不同類型的器官整合到一個芯片中，作為T2D體外疾病模型。使用定制的3D細(xì)胞打印機(jī)制造T2D芯片，選擇合適的細(xì)胞和生物墨水。使用定制的多頭打印機(jī)的好處是可以在短時間內(nèi)一步到位生產(chǎn)芯片，大大改善了細(xì)胞的生存能力，有利于精確和可重復(fù)的組織特異性微環(huán)境生產(chǎn)。實際制造的T2D芯片的每個隔室包含每個器官衍生的dECM生物墨水，每個器官衍生的細(xì)胞封裝在其中，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）作為一個單層位于每個隔室的頂部。同時在芯片上驗證了各器官之間的相互聯(lián)系，并確認(rèn)了芯片上根據(jù)器官順序的代謝狀況的變化。在雙器官芯片中，蛋白也被檢測到，但它們的表達(dá)明顯高于單器官芯片中的表達(dá)。綜合芯片在所有代謝物中顯示出最高的蛋白質(zhì)水平。這些結(jié)果表明，芯片上各器官之間的相互作用可以顯著提高代謝物水平。此外，為了證實對每個器官進(jìn)行分隔的效果，本文比較了空間不分隔芯片和空間分隔芯片的功能，結(jié)果顯示所有確定的標(biāo)記物在空間分離芯片中都比在空間不分離的芯片中明顯檢測得好。內(nèi)皮細(xì)胞的單層排列對產(chǎn)生成熟的血管結(jié)構(gòu)至關(guān)重要，這對表達(dá)器官的成熟表型和每個器官的正常功能都很重要。因此，芯片中必須有分層的內(nèi)皮細(xì)胞，以模擬功能正常的器官。

圖4 T2D芯片在T2D并發(fā)癥研究中的適用性

T2D相關(guān)器官有幾種并發(fā)癥，特別是與眼睛有關(guān)的并發(fā)癥很容易在體外模擬。本文通過連接一個正常的視網(wǎng)膜區(qū)間，將T2D的概念擴(kuò)展到T2D組合模型。為制作一個合適的T2D并發(fā)癥模型。本文實驗了裝有vadECM的模型是否比裝有sadECM或collagen的模型更接近于模擬T2D并發(fā)癥。連接T2D的正常視網(wǎng)膜室在芯片上穩(wěn)定了5天，用注射泵在特定的葡萄糖濃度下操作了2天。為了比較不同模型之間的功能，從每個芯片上收集了裝有RPE細(xì)胞的透析細(xì)胞，確認(rèn)緊密連接的崩潰程度和RPE細(xì)胞內(nèi)在功能變化。用相同的標(biāo)記物進(jìn)行qRT-PCR，以交叉檢查免疫熒光染色結(jié)果。在用vadECM和高糖培養(yǎng)基處理的芯片中，所有標(biāo)記物的表達(dá)都減少了，顯示了強(qiáng)烈的T2D特征。本文測量了各組跨膜電阻（TEER）值，定量緊密連接的破壞程度，以確認(rèn)RPE的功能。在高糖環(huán)境下配備vadECM的組的TEER值最低，表明該組的緊密連接是最崩潰的。綜上所述，在高血糖環(huán)境下，裝有vadECM芯片的炎癥細(xì)胞因子分泌量最高，從而主動促進(jìn)了RPE緊密連接的破壞，影響了RPE細(xì)胞的內(nèi)在功能。在這個模型中觀察到的由T2D條件引起的視網(wǎng)膜功能障礙證實了T2D芯片在T2D并發(fā)癥研究中的資格。

圖5 T2D芯片上治療T2D的商業(yè)藥物的反應(yīng)水平

接著研究人員檢查了治療T2D藥物是否在芯片上正常工作。Tol促進(jìn)胰腺分泌胰島素。Met阻礙肝臟的葡萄糖生成途徑，激活A(yù)MPK途徑，促進(jìn)葡萄糖流入細(xì)胞。因此，Tol和Met最終可以降低BGL。為了證實T2D芯片作為藥物測試平臺的潛力，我們制作了三種類型的模型。結(jié)果顯示在T2D模型中出現(xiàn)了葡萄糖不耐受和胰島素抵抗，但在正常模型中沒有。在T2D+Tol+Met模型中，從用Tol+Met治療開始，葡萄糖濃度下降，胰島素濃度迅速上升。相反，在沒有藥物治療的T2D模型中沒有發(fā)生。表明T2D治療劑恢復(fù)了細(xì)胞的功能，包括葡萄糖的吸收。隨后，隨著各器官細(xì)胞對葡萄糖吸收的進(jìn)展，葡萄糖濃度下降到正常范圍，導(dǎo)致胰島素分泌自然逐漸減少。在沒有藥物治療的T2D模型中，過度持續(xù)的胰島素分泌降在T2D模型中，持續(xù)的高血糖導(dǎo)致細(xì)胞膜崩潰，影響了INSR在細(xì)胞膜上的預(yù)發(fā)送。因此，與正常模型相比，INSR表達(dá)減少了。此外，由于炎癥細(xì)胞因子的增加，INSR磷酸化被抑制。

在T2D+Tol+Met模型中，細(xì)胞功能，包括細(xì)胞膜重建，得到了恢復(fù)。因此，與T2D模型相比，INSR的表達(dá)有所增加。此外，INSR的磷酸化得到恢復(fù)，從而重新啟動葡萄糖代謝，降低了BGL。用Met處理時，TNF-α和IL-6水平下降。每組不同的ELISA結(jié)果表明，Tol和Met達(dá)到了相同的T2D治療功效，但有不同的作用機(jī)制。在用Tol治療的T2D患者中，分泌了更多的胰島素。在用Met治療的T2D患者中，炎癥細(xì)胞因子的分泌減少。這些結(jié)果通過臨床試驗得到了證實。芯片上的藥物治療模式與在試驗中觀察到的病人一致。因此，該芯片可以作為T2D治療藥物的精確測試平臺。

總之，本文開發(fā)了一個模擬T2D的3D細(xì)胞打印多器官芯片。胰腺、AT和肝臟用組織特異性的dECM生物匯打印，并與一個灌注系統(tǒng)相互連接。開發(fā)的vadECM明顯增加了巨噬細(xì)胞和脂肪細(xì)胞中炎癥因子的產(chǎn)生。用來模擬T2D的病理環(huán)境。炎癥因子的釋放趨勢與一些臨床研究報告的T2D患者一致。芯片的制作采用最適合T2D模擬的器官分區(qū)和器官排列順序。所有隔間的血管都能改善器官功能。在芯片運行過程中，葡萄糖不耐受和胰島素抵抗的發(fā)生以及炎癥細(xì)胞因子的釋放導(dǎo)致葡萄糖代謝受損，導(dǎo)致整個胰島素信號傳導(dǎo)途徑出現(xiàn)問題。此外本文還分析了該芯片在研究T2D并發(fā)癥和藥物測試方面的有效性。與T2D芯片相連的RPE細(xì)胞在模擬器官并發(fā)癥的功能上出現(xiàn)了嚴(yán)重的問題。每種T2D治療藥物的機(jī)制在T2D芯片中可精確操作。該芯片對各種T2D并發(fā)癥的研究具有很大價值，可作為T2D藥物開發(fā)的精確測試平臺。

文章來源：
https://doi.org/10.1002/adfm.202213649