清華大學熊卓課題組AM：SPIRIT逐級懸浮打印技術，讓3D打印復雜器官有形更有“魂”！

來源：清華大學熊卓課題組

組織/器官的體外功能化重建是生物制造領域長期以來的努力目標；然而，組織器官的外部復雜結構和內部精細特征（如血管等）的耦合構建仍極具挑戰(zhàn)。為解決該難題，清華大學熊卓、張婷課題組（BRE團隊）提出了一種逐級懸浮3D打印技術（Sequential Printing in a Reversible Ink Template, 簡稱SPIRIT），相關成果近期以“Expanding Embedded 3D Bioprinting Capability for Engineering Complex Organs with Freeform Vascular Networks”為題發(fā)表在材料領域頂刊Advanced Materials（IF = 32.086）上。利用前期工作中開發(fā)的兼具剪切稀化和自愈合特性的微凝膠雙相（MB）生物墨水，SPIRIT技術通過將MB生物墨水在多級打印階段分別用作可打印墨水和懸浮介質，成功構建了含可灌注血管網(wǎng)絡的心室模型，這是現(xiàn)有生物3D打印技術所無法實現(xiàn)的。SPIRIT技術有效拓展了常規(guī)擠出3D打印的技術邊界，能夠實現(xiàn)具有復雜宏觀結構和精細血管的組織器官快速構建，有望加速工程化組織器官在醫(yī)學領域的轉化應用。

本文第一作者為清華大學機械系生物制造中心方永聰助理研究員，通訊作者為清華大學機械系生物制造中心副主任熊卓副教授。清華大學機械系生物制造中心主任孫偉教授、張婷副研究員及碩士生郭依涵、博士生吳炳炎等共同參與了本研究工作。該研究獲得了國家自然科學基金聯(lián)合基金重點資助項目(U21A20394)，清華大學人才引進啟動經(jīng)費基金(53330200321)，國家重點研發(fā)計劃項目(2018YFA0703004）和中國博士后科學基金站前資助 (2021TQ0184)等項目支持。

背景介紹
組織/器官的體外功能化重建是生物制造領域的難題之一，而生物3D打印技術憑借精確地逐層堆積生物材料的能力，引起了人們的極大興趣�？紤]到水凝膠的力學性能較差，懸浮生物3D打印技術受到了越來越多的關注。簡單來說，懸浮介質具有獨特的剪切稀化和自愈特性，在屈服應力下呈流態(tài)，在無應力下呈固態(tài)，能夠支撐生物墨水的自由成形，而懸浮介質可以通過清洗或升溫的方式被去除。例如，卡耐基梅隆大學的研究人員開發(fā)一種FRESH技術，可以將一個全尺寸的人類心臟模型懸浮打印到明膠微粒介質中。除了外部結構的復雜性外，構建功能化組織/器官的另一個障礙是缺乏分級血管網(wǎng)絡，限制了氧和營養(yǎng)物質的傳遞。犧牲模板技術和多材料打印技術被廣泛應用于在組織結構中構建復雜的血管網(wǎng)絡，近年來，懸浮生物3D打印同樣被用來打印具有更高仿生度的血管網(wǎng)絡。具體來說，將犧牲性墨水懸浮打印至負載細胞的懸浮介質，打印后將犧牲墨水溶出得到中空通道。例如，哈佛大學研究人員提出的SWIFT技術通過，通過將明膠犧牲墨水懸浮打印至類器官懸浮介質中，去除明膠后得到可灌注的血管網(wǎng)絡�？偨Y而言，F(xiàn)RESH技術能夠構建復雜外形，但很難成型血管網(wǎng)絡等內部結構；SWIFT技術能夠構建具有接近生理細胞密度的血管化組織，然而組織形狀在很大程度上受到容器的限制，很難復現(xiàn)天然組織和器官的外部結構。

因此，亟需開發(fā)一種新的3D打印工藝，以實現(xiàn)復雜組織器官的外部幾何特征和內部結構的耦合成形。為實現(xiàn)該目的，BRE團隊提出了逐級懸浮生物3D打印技術（稱為SPIRIT技術），至少包括i）在懸浮介質中打印生物墨水，得到組織和器官的復雜外部結構；iii）將犧牲墨水打印到初次打印但未交聯(lián)的結構中，獲得自由形態(tài)的血管網(wǎng)絡；iii）原位交聯(lián)，去除懸浮介質和犧牲墨水等步驟。SPIRIT技術的關鍵在于使用一種能夠同時作為打印墨水和懸浮介質的生物材料，該團隊采用了前期工作開發(fā)的載細胞微凝膠雙相生物墨水，其在較寬的溫度范圍內表現(xiàn)出良好的剪切稀化、自愈合以及快速原位光交聯(lián)能力，適合于SPIRIT打印技術。

圖1 逐級懸浮生物3D打印策略

1.MB生物墨水的表征和打印
MB生物墨水由微凝膠和水凝膠前驅體組成，通過微流控法來制備（圖2a），變異系數(shù)小于2.5%（圖2b）。通過流道設計和流速調節(jié)，能夠實現(xiàn)對微凝膠幾何形狀和大小的控制（圖2c）。MB生物墨水表現(xiàn)出優(yōu)異的打印性能，能夠打印成各種結構（圖2d-e）。負載hiPSCs的明膠/海藻酸鹽微凝膠通過鈣離子和微生物轉谷氨酰胺（mTG）酶進行雙交聯(lián)，交聯(lián)后的細胞活性處于中等水平（圖2f）。將微凝膠與相同的水凝膠前驅體混合，得到MB生物墨水（圖2g）。打印和交聯(lián)后，hiPSCs的活力略有下降（圖2h），表明打印過程對細胞活力有一定影響。在培養(yǎng)期間，hiPSCs繼續(xù)增殖，并傾向于以胚狀體（EB）的形式生長（圖2i）。胚狀體的直徑隨培養(yǎng)時間而增大（圖2j），表明其具有較快的增殖速度（圖2k）。第8天免疫熒光染色（圖2l）和流式分析（圖2m）證實hiPSCs能夠保持較好的全能性（>80%）。在加入心肌細胞分化培養(yǎng)基后，hiPSCs開始向心肌細胞分化（圖2n）。在分化14天后，觀察到跳動的心臟類器官（圖2o），證明載hiPSCs MB生物墨水可以通過原位增殖和分化來形成特定組織器官。

圖2 載細胞MB生物墨水的表征和生物3D打印

2.生物墨水的懸浮打印構建復雜結構體
以鋸齒形結構為例（圖3a）進行懸浮打印工藝參數(shù)的優(yōu)化，為定量比較打印結構和設計模型之間的差異，使用結構相似性指數(shù)（SSIM）來評估溫度對打印精度的影響。首先，將打印結構的圖像轉換為二值圖像，進行閾值分割，以確定平均絲寬和SSIM（圖3b）。結果顯示，提高打印溫度會導致細絲加寬，在24 ℃時SSIM最高（圖3c-d）。通過在恒定的打印速度下控制擠出速度，可以實時調節(jié)打印微絲的直徑（圖3e）。在Carbopol懸浮介質中打印了完整的心臟模型（圖3f-g）、開放腔室（圖3h-i）和支氣管模型（圖3j-k）。通過定量評估管狀結構的形狀保真度，進一步比較了直接打印和懸浮打印的打印精度（圖3l-m）。光交聯(lián)后將Carbopol懸浮介質去除，懸浮打印結構的外徑和高度略高于模型設定值，而直接打印樣本的尺寸略低于模型設定值（圖3n）。這可能是因為在懸浮介質存在的情況下，細絲層間連接相對不那么緊密。

懸浮打印結構體可以承受反復的高應變拉伸（圖3o-p），說明其具有優(yōu)異的力學性能。進一步，分別對鑄模和懸浮打印的實心圓柱體進行軸向壓縮測試，獲得應力-應變曲線，并計算彈性模量（圖3q）。懸浮打印結構的彈性模量約為鑄模結構的兩倍（圖3r），表明MB生物墨水的懸浮打印可以應用于軟組織結構的制造。進一步，以HepG2細胞為例測試懸浮打印工藝對細胞活性的影響。通過Live/Dead染色來評估細胞活性，并以載HepG2的純GelMA生物墨水作為對照（圖3s-t）。載細胞微凝膠在3D纖維中分布均勻，細胞活性略低于對照組的細胞活性（圖3u），可能原因包括MB生物墨水制備過程、Carbopol懸浮介質以及打印過程中的剪切應力；然而，懸浮打印結構中HepG2細胞在前5天表現(xiàn)出比對照組更快的生長速度（圖3v）。

圖3 懸浮打印MB生物墨水構建復雜結構體

3.以MB墨水為懸浮介質實現(xiàn)任意形狀血管打印
為驗證MB生物墨水作為懸浮介質的能力，將其轉移到一個透明容器中，成功實現(xiàn)了犧牲性明膠墨水的懸浮打�。▓D4a）。打印的細絲在不同的擠出速度下呈不同直徑，通過改變擠出速度，能夠控制細絲寬度為250 μm到1000 μm（圖4b-c）。MB生物墨水的流變性受溫度影響較小，但打印保真度在一定程度上仍會受到溫度變化的影響（圖4d）。為實現(xiàn)以MB生物墨水為懸浮基質的打印，將MB生物墨水填充到特定形狀的透明模具中，設計并打印了一條仿生的分叉通道（圖4e）。打印后，進行光交聯(lián)（圖4f-g），將溫度提高到37 ℃去除明膠，得到中空的通道。在通道中用藍色墨水灌流，證明它們的可灌注性（圖4h）。進一步制備載HepG2的MB生物墨水作為懸浮介質，在其中打印了可灌流通道，載HepG2的MB生物墨水的初始細胞活性為90%（圖4i）。灌流培養(yǎng)18小時后觀察，證明了通道灌流能夠顯著提高整個組織的細胞活性（圖4j）。

進一步，使用載HUVEC的明膠墨水可以在結構體中形成內皮化通道，在第3天，觀察到HUVECs均勻分布在通道中（圖4k）。第7天，細胞增殖使得通道內形成一層均勻的內皮層（圖4l），同時遷移到周圍基質中（圖4m）。此外，將紅色MB生物墨水在透明MB生物墨水中懸浮打印網(wǎng)格結構，擠出保真度良好（圖4n-o）。墨水和懸浮介質分別使用紅色和綠色GelMA微凝膠，實現(xiàn)了打印墨水分布可視化（圖4p）。這些結果都直接表明MB生物墨水既可以作為打印墨水，也可以用作懸浮介質。

圖4 MB生物墨水作為打印的懸浮介質

4.SPIRIT打印工藝
如前述，BRE團隊開發(fā)了新型逐級懸浮打�。⊿PIRIT）技術，打印過程如下：（i）一級打�。簩�MB生物墨水打印到Carbopol或明膠微顆粒懸浮介質中，構建復雜的外部結構；（ii）二級打印打印：在一級打印完成后，將犧牲墨水打印到尚未交聯(lián)的一級打印結構中，利用MB生物墨水的可逆自愈合性質來構建任意形狀的血管網(wǎng)絡；（iii）交聯(lián)：通過原位光交聯(lián)或溫度交聯(lián)，使打印的組織結構固化交聯(lián)，同時保持步驟（i-ii）中打印結構的結構完整性；（iv）去除懸浮介質和犧牲墨水：通過溫度變化或稀釋等方式去除懸浮介質從而得到打印結構，而犧牲墨水可以同時或單獨去除（圖5a）。與現(xiàn)有3D打印技術相比，SPIRIT技術可以構造出具有復雜外部和內部精細結構的組織和器官。

為探究墨水濃度對打印性能的影響，分別制備了含5wt%和7.5wt% GelMA MB生物墨水，使用Carbopol懸浮介質和紅色明膠來測試SPIRIT打印。在一級打印階段，5%和7.5 % MB生物墨水在Carbopol懸浮介質中均順利打印成中空管狀結構；然而在二級打印階段，針頭在7.5 % MB生物墨水中會出現(xiàn)移動和旋轉（圖5c），而5 % MB生物墨水則不明顯（圖5d）�？赡茉�因是7.5% MB生物墨水的剪切屈服應變遠遠高于懸浮介質，而5% MB生物墨水的剪切屈服應變則明顯低于懸浮介質（圖5e-f）。因此，采用5 % MB生物墨水打印了含螺旋細絲的管狀結構（圖5g-h），在去除懸浮介質和犧牲墨水后，成功用藍色培養(yǎng)液進行灌流（圖5i）。螺旋通道的尺寸接近設計值，表明SPIRIT打印具有良好的結構保真度（圖5j）；重復試驗中結構尺寸都非常相似，證明了SPIRIT技術具有高度可重復性（圖5k）。

圖5 基于MB生物墨水的SPIRIT工藝研究

5.SPIRIT打印含分級血管網(wǎng)絡的心室結構
心臟是一個中空的腔室器官，具有非常密集的血管網(wǎng)絡，然而現(xiàn)有生物3D打印技術尚無法構建兼具多腔室和血管網(wǎng)絡的組織結構，因此本研究以血管化心室模型的打印來證明SPIRIT技術的打印能力。首先，創(chuàng)建了一個簡化的心室模型，設計了一個位于心室模型中間表面的分級血管網(wǎng)絡（圖6a-b）。在使用MB生物墨水打印心室結構后（圖6c），繼續(xù)采用紅色明膠墨水進行二級打印以創(chuàng)建血管網(wǎng)絡（圖6d-f）。在二級打印階段，通過控制掃描次數(shù)或在恒定掃描速度下改變擠出速度來調節(jié)每個分支的直徑，最終成功打印了具有分級血管網(wǎng)絡的心室結構（圖6g-h）。在去除懸浮介質和犧牲墨水之后，心室內分級血管網(wǎng)絡可以進行反復的灌流（圖6i-j）。為充分測試SPIRIT的打印能力，本研究設計了一種更復雜形狀的血管網(wǎng)絡。首先在二維平面設計了一個樹枝狀血管網(wǎng)絡，進一步彎曲以形成類似于冠狀動脈的血管網(wǎng)絡（圖6k）。氧傳遞的數(shù)值模擬結果顯示致密的血管網(wǎng)絡可以顯著提高心肌腔室的氧供給效率（圖6l）。利用SPIRIT工藝成功打印了一個具有變化直徑的致密血管網(wǎng)絡（圖6m-n）。對打印結構進行微CT掃描，生成設計模型和打印結構之間偏差的云圖（圖6o），證明SPIRIT打印具有高形狀保真度。需要注意的是，即使被打印噴嘴剪切了數(shù)百次，打印心室的幾何形狀仍然完好無損。

進一步評估打印心室的功能，采用新生大鼠心肌細胞（NRVCs）制備了MB生物墨水，并打印簡化心室結構（圖6p）。將打印的心室剪切成數(shù)片（圖6q），并使用共聚焦成像來獲得結構和細胞信息。Live/Dead染色表明，在體外培養(yǎng)過程中，打印的血管網(wǎng)絡極大地促進了打印組織的活性（圖6r-s）。第10天，打印的心肌組織發(fā)生同步收縮（圖6f），免疫熒光染色證實了肌原纖維的形成和細胞的相互連接，表明打印心室的初步成熟（圖6u）。這些結果證實了SPIRIT打印心肌組織具有正常功能，顯示了SPIRIT技術在器官打印等醫(yī)學應用中的應用前景。

圖6 SPIRIT打印含可灌注血管網(wǎng)絡的腔室結構

總結與展望
本研究開發(fā)了一種新型逐級懸浮生物3D打�。⊿PIRIT）技術，能夠實現(xiàn)外部復雜結構和內部精細特征的耦合打印構建，并首次打印了一個具有復雜血管網(wǎng)絡的心室結構，其具有良好的灌注性和收縮性能。此外，SPIRIT技術能夠縮短打印時間，很好地兼容現(xiàn)有的懸浮介質和犧牲墨水體系，并可拓展到其他具有剪切稀化和自愈合特性的水凝膠墨水（如超分子水凝膠），為復雜組織/器官的體外功能重建提供了新的解決方案。

參考文獻：Fang Yongcong, Guo Yihan, Wu Bingyan, et al. Expanding Embedded 3D Bioprinting Capability for Engineering Complex Organs with Freeform Vascular Networks. Advanced Materials, 2023, 2205082.

doi: 10.1002/adma.202205082

關于BRE團隊：
Bioprinting and Regeneration Engineering（BRE）：清華大學生物制造中心生物打印與再生工程團隊，聚焦生物制造、生物3D打印、再生醫(yī)學、組織工程等前沿領域，分享進展，交流體會。