清華大學孫偉課題組：研發(fā)3D打印導電多尺度纖維支架，加速外周神經(jīng)損傷修復！

來源：BioMed科技

外周神經(jīng)損傷（PNI）修復是神經(jīng)外科領域的關鍵挑戰(zhàn)之一，神經(jīng)導管（NGC）作為潛在治療方法正日益受到關注。然而，現(xiàn)有生物制造技術仍難以構建具有仿生理化微環(huán)境的神經(jīng)導管，極大限制了實際治療效果。為解決該難題，清華大學機械工程系生物制造中心孫偉課題組基于跨尺度纖維復合增材制造技術，開發(fā)了一種導電多尺度纖維神經(jīng)導管（MF-NGC），為組織工程手段治療周圍神經(jīng)損傷提供了一種新思路。相關成果近期以“3D Printed Conductive Multiscale Nerve Guidance Conduit with Hierarchical Fibers for Peripheral Nerve Regeneration”為題發(fā)表在綜合類頂級期刊Advanced Science（IF=17.521）上。

本文第一作者為清華大學機械系生物制造中心方永聰助理研究員，王程錦博士生（已畢業(yè)）為共同第一作者，通訊作者為清華大學機械系生物制造中心主任孫偉教授、熊卓副教授和張磊副研究員。清華大學機械系生物制造中心張婷副研究員及劉子博博士生、高正訓本科生、陳李本科生等共同參與了本研究工作。該研究獲得了國家自然科學基金聯(lián)合基金重點資助項目（U21A20394），清華大學自主科研計劃（20197050024），清華大學人才引進啟動經(jīng)費基金（53330200321），國家重點研發(fā)計劃項目（2018YFA0703004）和中國博士后科學基金站前資助項目（2021TQ0184）等項目支持。

背景介紹
外周神經(jīng)損傷是神經(jīng)系統(tǒng)最常見的創(chuàng)傷性損傷之一，自體神經(jīng)移植是治療的金標準，但存在供體有限、供體功能喪失、神經(jīng)瘤形成、神經(jīng)扭曲或脫位、神經(jīng)直徑不匹配等問題。因此，近年來研究者致力于開發(fā)其替代品—神經(jīng)導管（NGC），通過提供機械支撐和有利微環(huán)境來促進神經(jīng)再生修復�，F(xiàn)有研究表明，NGC中引入各向異性拓撲結構能夠顯著促進外周神經(jīng)損傷的治療效果。目前主要通過冷凍干燥、靜電紡絲和3D打印等方法制備NGC，這些方法各有局限性，如冷凍干燥技術難以制備出復雜結構、規(guī)則孔隙的NGC，靜電紡絲技術具有可重復性差、可定制性差等固有局限性，3D打印技術（主要是熔融沉積工藝，F(xiàn)DM）通常只能產生相對較大的纖維直徑（>100μm），無法為軸突再生提供引導。近場靜電直寫技術（MEW）是熔體靜電紡絲與3D打印相結合的一種新興技術，可以實現(xiàn)亞微米纖維的精確定位，比常規(guī)3D打印技術小約2個數(shù)量級，在神經(jīng)導管制備方面得到應用。另外，研究人員逐漸認識到NGC電活性對神經(jīng)修復的重要性，并通過加入電活性材料（如碳納米材料、導電聚合物）或表面涂層等技術來開發(fā)導電性NGC；然而導電材料的加入可能影響MEW打印能力。

基于此，清華大學機械工程系生物制造中心孫偉課題組研發(fā)了基于熔融沉積成型技術（FDM）、熔融近場直寫技術（MEW）和靜電紡絲的跨尺度3D打印成形平臺，能夠可控制備從納米、微米到毫米級的多尺度纖維，同時提出一種導電多尺度纖維神經(jīng)導管（MF-NGC），提供可與天然組織相媲美的多層級結構和力電性能，在外周神經(jīng)修復方面具有“一石三鳥”之功效（如圖1），體現(xiàn)在：1）在納米尺度上，靜電紡絲工藝制備的PCL/膠原（PCL/col）納米纖維（直徑~500nm）構成MF-NGC外層，具有良好的滲透性，在促進營養(yǎng)物質擴散同時阻礙成纖維細胞的浸潤；2）在微觀尺度上，采用MEW技術打印出直徑~10μm的取向排列PCL微纖維，為神經(jīng)再生提供引導；3）在介觀尺度上，用MEW技術打印出直徑~125μm的PCL/石墨烯（PCL/rGO）微纖維，提供了所需的機械穩(wěn)定性和導電性能。

圖1：導電多尺度纖維神經(jīng)導管的設計示意圖

實驗結果
1. MF-NGC支架的制備與形貌表征
本研究提出的導電多尺度纖維神經(jīng)導管制備過程如下：1）通過在旋轉軸上依次打印PCL微纖維、PCL/rGO微纖維和PCL/col納米纖維，制備中空神經(jīng)導管；2）將PCL、PCL/rGO微纖維通過MEW打印成纖維片并卷曲填充到中空導管中構成MF-NGC。如圖2所示，MF-NGC由直徑500nm~125μm多尺度纖維組成，長度為15mm，外壁厚度為~500μm，打印成形使得其具有高度重復性的優(yōu)勢。SEM圖像顯示，MF-NGC內層由PCL微纖維和PCL/rGO導電微纖維密集填充。另外，外層含有隨機納米纖維和定向微纖維，模擬了天然神經(jīng)外膜的結構特征，有利于功能神經(jīng)的形成。

圖2 MF-NGC支架的制備和形貌表征

2. MF-NGC支架的力學和電學性能評價
MH-NGC與MH-NGC在壓縮測試中均表現(xiàn)出良好的壓縮恢復能力和結構完整性，但MF-NGC的最大應力是MH-NGC的20倍（圖3）。有限元分析表明，在5N的壓力作用下，MF-NGC的形變顯著小于MH-NGC，機械強度與較粗纖維（200μm）相當。同樣，在拉伸測試中，MF-NGC應力在整個測試過程中顯著高于MH-NGC。另外，MF-NGC斷裂處伸長率超過100%，說明具有良好的回彈性。與MH-NGC相比，MF-NGC可以在更長的拉伸距離（~5mm）上承受更高的應力（~1.7N），并且在PCL中摻入（0.5mg）GO可以顯著改善MF-NGC的力學性能，同時rGO/PCL的電導率顯著高于純PCL，這些結果表明MF-NGC滿足所需的導電性能和機械穩(wěn)定性要求。

圖3 MF-NGC支架的力學和電學性能評價

3. MF-NGC支架的體外生物學評價
雪旺細胞（SC）通過分泌神經(jīng)營養(yǎng)分子促進外周神經(jīng)軸突生長，因此，本研究將RSC96細胞種植到平面多尺度纖維支架，其由隨機排列的納米纖維和內部定向的微纖維組成（圖4）。大部分SC在第1天呈不成熟的圓形形態(tài)，培養(yǎng)7天后SC增殖并覆蓋整個支架，說明纖維支架能夠促進SC增殖。

第7天細胞骨架染色顯示SC典型的紡錘狀形態(tài)，同時SEM圖像顯示SC沿著定向微纖維生長，說明定向微纖維具有引導SC生長的作用。PC12細胞是一種具有與神經(jīng)元相似特性的細胞模型，將PC12細胞種植在支架上可以觀察到類似結果。另外，PC12細胞的軸突平均長度從第1天的9.6±2.7μm顯著增加到第7天的42.5±12.8μm；同時，RSC96細胞定向比例（-10°~10°）大于80%，PC12細胞定向比例大于90%，表明多尺度纖維支架能夠體外調控神經(jīng)再生相關細胞的生長。

圖4 MF-NGC支架的體外生物學評價

4. MF-NGC支架的體內神經(jīng)修復評價
本研究制備長度為15mm的MH-NGC和MF-NGC，并分別植入到SD大鼠坐骨神經(jīng)缺損部位，同時采用自體移植物作為陽性對照。術后4周后，神經(jīng)組織再生延伸至所有導管且沒有觀察到纖維細胞的浸潤；第4和8周MF-NGC中心區(qū)S-100和NF-200的陽性面積顯著大于MH-NGC，與自體移植物組無顯著差異。在血管化和免疫調控方面，第4周和8周的vWF染色結果顯示MF-NGC中微血管密度顯著高于MH-NGC，表明填充定向微纖維的神經(jīng)導管支架可促進血管新生；第8周MF-NGC組M2/M1比值（4.8±1.5）顯著高于MH-NGC組（1.8±0.7），表明其具有促巨噬細胞招募與向促再生M2表型轉變的能力。

在髓鞘形成方面，利用透射電鏡分析髓鞘的厚度和數(shù)量，第4周MF-NGC組髓鞘厚度（522±85nm）顯著高于MH-NGC組（409±62nm），與自體移植物組（544±75nm）相當；第8周各組髓鞘厚度均增加，MF-NGC的髓鞘數(shù)量（19±2個/FOV）顯著多于MH-NGC組（9±2個/FOV）（如圖5）。在腓腸肌恢復方面，第8周自體移植物組（57±5μm）和MF-NGC組（44±8μm）顯著厚于MH-NGC組（19±6μm），且MF-NGC組膠原纖維面積（7.1%±4.0%）顯著小于MH-NGC組（20.0%±3.0%），略高于自體移植物組（3.2%±1.6%），說明MF-NGC植入后可顯著緩解軸突截斷引起的肌肉萎縮。在腿部功能恢復方面，第4周MH-NGC組SFI（-77.4±4.2）低于自體移植組（-58.9±10.8）和MF-NGC組（-74.7±11.5），第8周MF-NGC組SFI（-51.5±8.6）顯著高于MH-NGC組（-61.4.9±4.6）并與自體移植物組（-50.4±14.3）相當。綜上，這些實驗結果表明MF-NGC能夠顯著促進神經(jīng)再生，達到與自體移植相當?shù)乃�平�?br />

圖5 坐骨神經(jīng)再生修復評價

結論
本研究通過復合增材制造技術，設計開發(fā)了一種導電多尺度纖維神經(jīng)導管，其表現(xiàn)出良好的纖維取向性、滲透性、導電性和機械穩(wěn)定性，通過大鼠坐骨神經(jīng)缺損模型發(fā)現(xiàn)其能夠快速募集血管細胞和調節(jié)巨噬細胞向M2表型轉變，顯著促進外周神經(jīng)再生、髓鞘形成和腓腸肌等功能恢復，為組織工程手段治療周圍神經(jīng)損傷開辟了新的途徑。

文章鏈接：
Yongcong Fang, Wang Chengjin, Liu Zibo, et al. 3D Printed Conductive Multiscale Nerve Guidance Conduit with Hierarchical Fibers for Peripheral Nerve Regeneration. Advanced Science, 2023, 2205744.（doi: 10.1002/advs.202205744）