通過水相嵌入式生物打印的界面凝聚實現(xiàn)相互連接管狀通道自由形式3D網(wǎng)絡(luò)進行原位內(nèi)皮化

來源：EngineeringForLife

再生醫(yī)學(xué)、高通量藥物篩選和器官移植的新興需求加速了組織樣結(jié)構(gòu)物和器官的體外生產(chǎn)的發(fā)展。其中，血管網(wǎng)絡(luò)對于產(chǎn)生有功能的組織是至關(guān)重要的，因為它們提供必要的營養(yǎng)物質(zhì)、氧氣、生長因子，以及清除廢物。三維生物打印作為一種復(fù)制血管化組織空間復(fù)雜性的萬能工具，前景廣闊。然而，結(jié)構(gòu)復(fù)雜、相互連接的可灌注腔的三維網(wǎng)絡(luò)仍然難以實現(xiàn)。使用瞬變油墨的3D擠壓生物打印和基于數(shù)字光處理(DLP)的生物打印都能夠生產(chǎn)相互連接的通道的3D網(wǎng)絡(luò)，這些通道可以用內(nèi)皮細(xì)胞進行后期播種。然而，這兩個過程都涉及多個步驟，包括模板刪除、重復(fù)清理和后期播種。這些后期處理可能會影響結(jié)構(gòu)精度，并喪失3D增材制造的固有優(yōu)勢，如快速原型和簡單性。更重要的是，這些方法中使用的大多數(shù)模板材料，如Pluronic F-127和碳水化合物玻璃，要么不適合攜帶細(xì)胞，要么對細(xì)胞有劇毒。因此，這些方法不支持對播種效率和均勻性要求很高的細(xì)胞原位播種。

2022年11月30日，來自深圳大學(xué)孔湉湉副教授、劉洲副研究員及其團隊在《Advanced Materials》雜志發(fā)表題為“In-situ endothelialization of freeform 3D network of interconnected tubular channels via interfacial coacervation by aqueous-in-aqueous embedded bioprinting”的研究論文，提出了通過ATPS嵌入式生物打印通過界面凝聚在相互連接的細(xì)胞襯里管狀通道的自由形態(tài)3D血管網(wǎng)絡(luò)的體外生產(chǎn)。新制備的ATPS的界面凝聚不僅保持了水-水結(jié)構(gòu)，而且可以作為細(xì)胞附著和生長的絲狀支架。

1. 一步法完成任意設(shè)計的空心通道互聯(lián)3D網(wǎng)絡(luò)和原位細(xì)胞播種
為了在原位細(xì)胞播種的情況下自由構(gòu)建微通道的血管網(wǎng)絡(luò)，研究者設(shè)計了一種在界面處產(chǎn)生凝聚復(fù)合物的雙水相體系，用于細(xì)胞附著和生長。墨水相由右旋糖酐(DEX)、聚賴氨酸(PLL)和活細(xì)胞組成，而基質(zhì)相是oxBC納米纖維和聚乙二醇(PEG)的水溶液混合物。為了形成凝聚復(fù)合物，選擇了弱聚陽離子【因為強聚陽離子具有細(xì)胞毒性，如聚乙烯亞胺(PEI)、聚丙烯胺鹽酸鹽(PAH)、聚二烯丙基二甲基氯化銨(PDDA)和氯殼聚糖(HACC)】，聚賴氨酸(PLL)作為攜帶細(xì)胞的墨水相。同時，由于具有羧基的oxBC納米纖維可以為所得到的凝聚復(fù)合物提供足夠的機械支撐和絲狀形態(tài)，因此被用作聚陰離子。PLL和oxBC都是水解和酶降解的聚電解質(zhì)。因此，當(dāng)油墨相被擠出到基體中時，油墨中的PLL與基體中的oxBC瞬間在水/水界面處形成凝聚絡(luò)合物;oxBC的電離羧基和PLL的質(zhì)子化氨基之間的靜電絡(luò)合產(chǎn)生了絲狀膜，作為細(xì)胞粘附的支架。為了在基質(zhì)中保持沉積油墨的任意結(jié)構(gòu)，兩種水相都被調(diào)整為剪切減薄和屈服應(yīng)力液體。當(dāng)oxBC濃度為0.5 ~ 3 wt%時，基體的屈服應(yīng)力約為1 Pa; 而油墨的壓力約為5mpa。因此，通過將PLL/oxBC的細(xì)胞負(fù)載ATPS與嵌入式生物打印相結(jié)合，可以一步完成任意設(shè)計的空心通道互聯(lián)3D網(wǎng)絡(luò)和原位細(xì)胞播種。（圖1）

圖1 研究重點和工作流程的示意圖

2. oxBC和PLL在水/水界面的復(fù)合凝聚是原位形成膜支架和原位細(xì)胞播種的關(guān)鍵
PLL分子與oxBC納米纖維絡(luò)合形成的膜質(zhì)支架呈絲狀，適合細(xì)胞粘附和擴散。為了優(yōu)化膜質(zhì)支架的理化性能，進一步研究了膜質(zhì)支架的界面凝聚過程。一旦墨水相被擠壓到基質(zhì)相，PLL分子和oxBC納米纖維在界面上的相互擴散就由濃度梯度決定。由于PLL分子的尺寸比oxBC納米纖維小得多，因此PLL分子的擴散主導(dǎo)了復(fù)合凝聚過程。因此，PLL的初始濃度較高會導(dǎo)致更厚的凝聚復(fù)合體層。事實上，凝聚PLL/oxBC層的平衡厚度隨PLL濃度線性增加。相反，當(dāng)oxBC的濃度從0.25 wt%增加到3 wt%時，聚結(jié)絡(luò)合物層變薄。這可能是由于在界面另一側(cè)有更多的oxBC納米纖維被PLL分子凝聚，形成了網(wǎng)絡(luò)更密集的凝聚復(fù)合體。密集的網(wǎng)絡(luò)抑制了PLL的后續(xù)擴散，呈現(xiàn)出較薄的凝聚復(fù)合物層。oxBC濃度越高，對PLL擴散的抑制作用越明顯。當(dāng)PLL墨水在oxBC介質(zhì)中轉(zhuǎn)換時，管狀結(jié)構(gòu)立即出現(xiàn)。PLL濃度越高，oxBC濃度越低，得到的管狀結(jié)構(gòu)越厚。管狀結(jié)構(gòu)的滲透性主要由oxBC濃度決定。由于納米纖維的密集網(wǎng)絡(luò)，PLL/oxBC凝聚配合物的管狀結(jié)構(gòu)具有101-102 kPa的彈性模量，與典型的水凝膠相似，提供了結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和適合在水浴中生長的支持結(jié)構(gòu)。膜支架的滲透性測試進一步支持了PLL擴散為主的過程。我們發(fā)現(xiàn)，粒徑大于500kda的分子很難在凝聚凝膠膜上擴散。因此，再次證實了界面凝聚主要是由PLL擴散驅(qū)動的，并在PLL分子耗盡時終止。因此，通過調(diào)節(jié)PLL和oxBC的濃度，PLL/oxBC凝聚配合物可以形成穩(wěn)健的管狀結(jié)構(gòu)。（圖2）

圖2 ATPS界面凝聚配合物的形成機理及理化性質(zhì)

3. 形成可變尺寸和自由結(jié)構(gòu)相互連接的可灌注微通道的三維網(wǎng)絡(luò)
生物打印機可以實現(xiàn)任意的3D結(jié)構(gòu)。為了確保墨水中細(xì)胞的活力，該研究測試了施加壓力和滲透壓對細(xì)胞活力的影響。發(fā)現(xiàn)滲透壓小于30 mOsm·kg-1和施加壓力在100 kPa以內(nèi)對細(xì)胞活力的影響可以忽略不計。隨后，通過改變打印機頭的大小，應(yīng)用不同的壓力和平移速度進行擠壓，測量擠壓螺紋的直徑。例如，當(dāng)P = 66.192 kPa (9.6 PSI)， d =100 μm時，隨著平移速度從1.67 mm·s-1到25 mm·s-1，打印絲的直徑可以從1800 μm無縫變化到200 μm。因此，可以通過調(diào)節(jié)平移速度和施加壓力來控制擠壓后可灌注微通道的尺寸。因此，使用細(xì)胞負(fù)載墨水創(chuàng)建并在水環(huán)境中保存良好的具有相互連接的空心腔的分支網(wǎng)絡(luò)，其中可灌注的微通道分裂成較小尺寸的子微通道，就像是血管分叉。同樣，一系列互聯(lián)網(wǎng)絡(luò)的可滲透性可以構(gòu)建和保留具有矩形金字塔、長方體、螺旋和正多面體等空間結(jié)構(gòu)的微通道。這些中空結(jié)構(gòu)是足夠堅固的處理和替代在其他懸浮浴，如細(xì)胞培養(yǎng)基。為了優(yōu)化細(xì)胞活力，通常在打印后10分鐘將含有細(xì)胞的結(jié)構(gòu)從原始的ATPS培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)基中。最后，該方法可以用任意設(shè)計制造堅固的、細(xì)胞負(fù)載的、可灌注的互連管腔的血管樣網(wǎng)絡(luò)。（圖3）

圖3 利用PLL/oxBC嵌入式生物打印技術(shù)構(gòu)建可灌注互聯(lián)腔的任意類血管網(wǎng)絡(luò)

4. 賦予打印的血管網(wǎng)絡(luò)生物功能
為了賦予打印的血管網(wǎng)絡(luò)生物功能，該研究在墨水階段混合內(nèi)皮細(xì)胞，以促進在打印微通道的管腔上進行原位播種。優(yōu)化并固定PLL的濃度為0.05 wt%， oxBC相的濃度為0.5 wt%，以同時確保細(xì)胞相容性、細(xì)胞附著性和印刷適性。打印結(jié)構(gòu)后，將其轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)基中進行后續(xù)操作。發(fā)現(xiàn)PLL/oxBC支架上的種子細(xì)胞在第1天開始擴散和增殖，在第3天微通道內(nèi)表面形成均勻的細(xì)胞襯里。PLL/oxBC納米纖維的靜態(tài)附著期和絲狀網(wǎng)絡(luò)的結(jié)合，有助于將良好的細(xì)胞粘附、擴散和增殖。由于墨水階段的細(xì)胞不能在界面上擴散，因此它們附著在界面上的凝聚復(fù)合體上。據(jù)報道，內(nèi)皮細(xì)胞與支架的靜態(tài)附著時間對于形成穩(wěn)定的內(nèi)皮單層很重要。使用同樣的方法，發(fā)現(xiàn)很少有內(nèi)皮細(xì)胞可以附著在PLL/藻酸鹽支架上，它們的形態(tài)保持球形且不增殖。相比之下，PLL/oxBC支架上的種子細(xì)胞在7天內(nèi)增殖175%，表明oxBC的納米纖維網(wǎng)絡(luò)，類似于膠原纖維的納米纖維網(wǎng)絡(luò)，可以招募內(nèi)皮細(xì)胞并促進細(xì)胞生長。培養(yǎng)3天后，內(nèi)皮細(xì)胞粘附增加。提示在存在完整的內(nèi)皮單層時，細(xì)胞間接觸良好。平滑肌細(xì)胞也有相同表型。為了評估生成的血管網(wǎng)絡(luò)的功能，研究了其灌注和滲透性特征。結(jié)果表明，通過結(jié)合細(xì)胞負(fù)載ATPS墨水和嵌入式生物打印的方法，內(nèi)皮單層足以模擬血管的屏障功能。因此，該方法為構(gòu)建內(nèi)皮管腔生物功能復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)提供了一種方便有效的方法。（圖4）

圖4 人造維管組織結(jié)構(gòu)物的雙重功能

本研究通過在水-水三維嵌入式生物打印中利用界面凝聚策略，生成了具有自由形態(tài)結(jié)構(gòu)的可灌注互連管腔的內(nèi)皮血管網(wǎng)絡(luò)。這種方法允許保留液中液任意結(jié)構(gòu)，也可以作為堅固的絲狀支架，用于在墨水階段原位播下活細(xì)胞。該方法的建立，為未來創(chuàng)建厚的血管化組織、構(gòu)建基礎(chǔ)病理和生理研究的模型、以及藥物評估應(yīng)用方面提供一種新方法、新思路。

文章來源:
https://doi.org/10.1002/adma.202209263