納米粒子也能治療癌癥？姜黃素結合3D腫瘤模型給出肯定答案

來源： EngineeringForLife

與傳統(tǒng)治療方法相比，納米藥物因其具有更好的靶向性、更高的給藥效率和良好的水溶性而引起越來越多的關注。然而，傳統(tǒng)的藥物療效評估方法是基于單細胞的2D培養(yǎng)方法來獲得體外治療效果，這可能不能代表實際腫瘤�；�于上述考慮，3D細胞培養(yǎng)模型成為更好的選擇，因為它們可以增加體外系統(tǒng)的復雜性，并提供比2D培養(yǎng)更接近體內原生的仿生微環(huán)境。

為此，來自大連理工大學的宋克東研究員將聚合非離子表面活性劑(Pluronic F127)與姜黃素結合，制備了水溶性好、治療腫瘤效果好的姜黃素納米顆粒(CurNPs)（圖1）。以納米粘土、海藻酸鈉和明膠為基礎制備的雜化支架具有良好的印刷相容性和良好的生物相容性。之后使用支架結合的轉移性乳腺癌(MDA-MB-231)細胞構建3D腫瘤模型，研究了CurNPs對轉移性乳腺癌的治療作用（圖1）。相關研究成果以“Curcumin nanoparticles combined with 3D printed bionic tumor models for breast cancer treatment”為題于2022年12月8日發(fā)表在《Biofabrication》上。

圖1 CurNPs聯(lián)合3D打印Gel/Alg/NC支架治療乳腺癌腫瘤示意圖

1. CurNPs的制備及其性能特征
首先，作者以姜黃素(Cur)和Pluronic F-127 (PF127)為原料采用納米沉淀法制備了姜黃素納米顆粒(CurNPs)。通過各種理化表征對CurNPs的性質進行了特異性分析，并通過體外藥物篩選，研究了CurNPs在二維環(huán)境下對乳腺癌細胞(MDA-MB-231)和正常細胞(L929)的細胞毒性。（圖2）。

圖2 CurNPs的生物毒性試驗

2. 生物墨水的特征
在二維環(huán)境下的單細胞研究無法模擬體內微環(huán)境的固有細胞組成和行為特征，從而限制了其體外和體內效應之間的精確對應因此，為了更好地模擬體內腫瘤微環(huán)境，作者對具有良好生物相容性和流變性能的3D打印Gel/Alg/NC支架進行了研究。

將海藻酸鹽/明膠前驅體溶液中加入納米粘土（NC）作為打印支撐材料，在超純水中按5:4:1的質量分數(shù)比(Gel:NC:Alg)制備得到的油墨粘性更大（圖4a左）。流變結果表明所制備的油墨具有良好的剪切減薄性能和良好的印刷適性。油墨之間存在較強的相互作用力，這為印刷后的形狀保持奠定了良好的理論基礎。此外，油墨的觸變性表征了流體粘度對時間的依賴關系。還測量了剪切應力隨剪切速率的變化，結果表明，剪切應力-剪切速率曲線的面積較大，說明油墨的觸變性大，穩(wěn)定性高，不易變形（圖3）。

圖3 Gel/Alg/NC油墨的流變性能測試

由此打印出的支架結構平整，具有良好的支撐性能，不易倒塌（圖4a右）。利用掃描電鏡可以更直觀地觀察到鈣離子交聯(lián)和EDC/NHS/MES二次交聯(lián)后3D打印支架的微觀形貌。從圖6b可以發(fā)現(xiàn)，交聯(lián)后的支架孔隙明顯，表面不規(guī)則且粗糙(圖4c)，這為細胞的粘附奠定了基礎。EDS進一步說明了支架的組成成分，接觸角的降低說明支架的親水性良好更有利于細胞的粘附。

圖4 三維Gel/Alg/NC支架的物理性能表征

3. CurNPs在三維腫瘤模型/環(huán)境中的細胞毒性試驗及其作用機制
良好的生物相容性是建立腫瘤模型的先決條件。本研究首先采用活/死染色和CCK-8法檢測支架上L929細胞和MDA-MB-231細胞的增殖情況，為腫瘤模型的構建奠定基礎。結果表明3D打印Gel/Alg/NC雜化支架中L929細胞和MDA-MB-231細胞的增殖活性均較好，兩組間增殖能力無明顯差異。說明所制備的Gel/Alg/NC雜化支架具有良好的生物相容性，均能促進成年正常細胞(L929)和乳腺癌細胞(MDA-MB-231)的粘附和增殖(（圖5）。

圖5 三維Gel/Alg/NC復合支架細胞增殖試驗

此外，作者還對CurNPs在三維腫瘤模型/環(huán)境中的細胞毒性進行了試驗。對于用CurNPs處理的腫瘤模型，如圖6所示，隨著時間的增加，加入CurNPs后，綠色熒光逐漸減少，表明活細胞數(shù)量逐漸減少，而紅色熒光逐漸增加，表明死亡細胞數(shù)量逐漸增加。在CurNPs處理的2D孔板中培養(yǎng)的細胞在24小時內達到了約90%的細胞死亡率。

圖6 CurNPs在3D Gel/Alg/NC雜化支架上的細胞毒性測試

接下來，作者通過3D Gel/Alg/NC支架的H&E染色進一步研究了CurNPs對3D培養(yǎng)的MDA-MB-231細胞的殺傷作用(圖7)。從H&E染色結果可以看出，CurNPs處理4天后，空白對照組的大部分細胞呈球形聚集狀態(tài)。而CurNPs組的細胞數(shù)量較未處理的空白對照組更為稀疏和分散，且大部分細胞核可見斷裂，導致染色效果較差。上述結果表明，CurNPs能夠抑制3D Gel/Alg/NC支架培養(yǎng)的MDA-MB-231細胞，具有良好的細胞毒性（圖7）。

圖7 H&E染色分析CurNPs對3D腫瘤模型MDA-MB-231的影響

接下來，作者進一步在3D支架上通過免疫熒光檢測MDA-MB-231細胞中凋亡蛋白(Bcl-2和Bax)的表達，探討CurNPs對腫瘤模型的作用機制。與對照組相比，三維支架腫瘤模型中MDA-MB-231細胞的Bcl-2熒光(488 nm和594 nm)表達在CurNPs處理4 d后顯著降低(P < 0.001)。定量分析顯示Bcl-2熒光強度明顯低于對照組，表明CurNPs可以抑制Bcl-2的表達（圖8a-b）。然后分析細胞凋亡促進因子Bax的表達，CurNPs處理的三維腫瘤模型顯示出明顯的熒光增強，表明CurNPs可以上調支架內MDA-MB231細胞中Bax的表達（圖8c-d）。上述結果表明，CurNPs可以通過改變3D腫瘤模型MDA-MB-231細胞中凋亡相關蛋白的表達來促進細胞凋亡。

圖8 CurNPs處理的3D Gel/Alg/NC支架的免疫熒光分析

4. CurNPs和3D打印Gel/Alg/NC支架的生物安全性評價
最后，作者通過溶血實驗評估了CurNPs和3D Gel/Alg/NC支架的體內血液相容性。結果表明在CurNPs和3D支架中均沒有溶血現(xiàn)象（圖9a-b）。作者又分別在96孔板中取出100μl溶血樣品，在570 nm波長下，每個樣品平行檢測3個，計算溶血率，結果如圖9c-d所示，實驗組溶血率接近0%，與圖9a-b結果一致，進一步證明了CurNPs和3D Gel/Alg/NC支架均具有良好的血液相容性和生物安全性。

圖9 CurNPs與3D Gel/Alg/NC支架的血液相容性研究

綜上，本文通過簡單的納米沉淀法成功制備了一種納米治療藥物CurNPs，所制備的CurNPs具有良好的生物相容性、滿足的水溶性、良好的發(fā)光性、通過EPR效應有效的細胞內食以及有效的腫瘤治療效果等優(yōu)點。此外，通過簡單的合成方法建立了具有良好力學和流變學性能的體外支架腫瘤模型，并通過CCK8、活/死細胞染色、SEM等方法驗證了該三維支架能夠更好地模擬體內腫瘤微環(huán)境，能夠較好地代表實際腫瘤，從而更準確地進行體外藥物篩選�；�于上述分析，本研究為構建多功能納米藥物體外藥物篩選多平臺開辟了新途徑。

文章來源：
https://iopscience.iop.org/article/10.1088/1758-5090/aca5b8