3D水凝膠內(nèi)熔融靜電打印可犧牲纖維制造

供稿人：李晨、賀健康 供稿單位：西安交通大學(xué)機(jī)械制造系統(tǒng)工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

隨著3D組織模型在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和藥學(xué)領(lǐng)域的興起，人們越來越意識(shí)到傳統(tǒng)2D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的局限性，因?yàn)?D組織模型可以獲得更準(zhǔn)確的結(jié)果，這主要依賴于其能創(chuàng)建更真實(shí)的細(xì)胞環(huán)境，因?yàn)?D組織模型中的細(xì)胞間和胞質(zhì)間相互作用與體內(nèi)條件更加接近，并且這些人工3D組織也可能被用作再生醫(yī)學(xué)的組織替代物。然而，由于細(xì)胞基質(zhì)和細(xì)胞密度的限制，創(chuàng)建尺寸在0.6mm-1mm之間的人工3D組織模型仍然是一個(gè)關(guān)鍵的挑戰(zhàn)。并且，人工3D基質(zhì)應(yīng)盡可能模擬復(fù)雜的細(xì)胞相互作用，并促進(jìn)細(xì)胞在3D環(huán)境中的附著、存活和增殖。

針對上述問題，維爾茨堡大學(xué)功能材料與生物制造研究所的研究人員提出了利用熱敏材料的犧牲支架，將其整合在水凝膠中制造仿生微血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的制造策略。使用熔融靜電打印技術(shù)打印可犧牲熱敏材料支架，制造具有高精度微流道模板，使用水凝膠前體溶液在25℃以上填充，并在25℃以下與水凝膠融合形成高精度的可灌注仿生微血管網(wǎng)絡(luò)。其制造的分叉結(jié)構(gòu)平均直徑在87μm-275μm之間，并且通過在流道內(nèi)灌注細(xì)胞，可以在三天內(nèi)快速形成緊密且具有生物功能的內(nèi)皮層。

研究人員通過使用不同的顯微技術(shù)對微流道內(nèi)細(xì)胞的細(xì)胞核、CD31和F-actin進(jìn)行染色和評(píng)估，以檢測細(xì)胞形態(tài)和3D流道內(nèi)的流變附著情況。結(jié)果顯示細(xì)胞均勻附著在管腔表面，且細(xì)胞數(shù)量較多(圖1A)。并且可以看到內(nèi)皮細(xì)胞形成的內(nèi)皮單層均勻充滿微流道表面(圖1B)。基于內(nèi)皮化微流道的三維模型重建，研究人員還對分叉流道的細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行了數(shù)值流動(dòng)模擬(圖1C)，分析表示介質(zhì)通過分支時(shí)雖然速度略有上升，但并沒有顯著影響壁剪應(yīng)力。通過對具有不同分叉角度的微流道中的流體進(jìn)行數(shù)值模擬，分析了分叉角度對三種不同微通道設(shè)計(jì)的影響(圖3D)。分析表明流體速度和剪應(yīng)力并不會(huì)隨著分叉角度的增加而顯著改變。

圖 1 微流道內(nèi)皮化的表征。(A)微流道管腔上CD31陽性內(nèi)皮單層的3D圖像。(B)具有內(nèi)皮層的完整微流道的多光子成像。(C)嵌入微血管中流動(dòng)的數(shù)值分析。基于(B)中內(nèi)皮化樣品的幾何特征，在3D模型中灌注細(xì)胞培養(yǎng)基的流動(dòng)剖面和誘導(dǎo)壁剪應(yīng)力。(D)在具有不同分叉角度的微流道的參數(shù)化三維設(shè)計(jì)中，計(jì)算血液灌注的流動(dòng)剖面和誘導(dǎo)壁剪切應(yīng)力。

為了研究內(nèi)皮層的通透性，研究者使用了兩種不同尺度的異硫氰酸熒光素標(biāo)記的葡聚糖，分別為20kDa和200kDa，在注射葡聚糖開始時(shí)和2小時(shí)后分別觀察其在水凝膠基質(zhì)中的擴(kuò)散情況(圖2A)。通過測量內(nèi)皮化與非內(nèi)皮化微流道內(nèi)和周圍水凝膠基質(zhì)中的熒光強(qiáng)度，以評(píng)估內(nèi)皮層提供的屏障功能。結(jié)果表明內(nèi)皮層的存在大大減少了兩種尺度葡聚糖向水凝膠基質(zhì)中的擴(kuò)散程度(圖2B)。注射20kDa和200kDa葡聚糖后，與非內(nèi)皮化流道相比，內(nèi)皮化流道中觀察到的向周圍水凝膠的擴(kuò)散減少了約25%和30%(圖2C, D)。結(jié)果表明微流道內(nèi)的內(nèi)皮層足以模擬血管的屏障功能。

圖 2 熒光標(biāo)記葡聚糖檢驗(yàn)的微流道內(nèi)內(nèi)皮層通透性。(A)在微流道中灌注葡聚糖后0 - 2小時(shí)的熒光圖像。左：20kD葡聚糖；右：200kDa葡聚糖。(B)有無內(nèi)皮層微通道間擴(kuò)散速率的比較：葡聚糖分子擴(kuò)散到水凝膠中的熒光強(qiáng)度。(C, D)兩種尺度葡聚糖擴(kuò)散的百分比計(jì)算。

盡管該方法成功制造了具有內(nèi)皮功能的可灌注仿生微血管網(wǎng)絡(luò)，但依然有需要改進(jìn)的地方。例如，在熔融靜電打印出的可犧牲支架中填充水凝膠前體溶液時(shí)，由于支架的力學(xué)性能較差，無法維持打印支架的形狀，導(dǎo)致微流道的結(jié)構(gòu)無法按照預(yù)期的設(shè)定在水凝膠中形成；當(dāng)制造復(fù)雜結(jié)構(gòu)的微流道時(shí)，無法保證所有流道的成型精度。在未來，可以通過改變材料的屬性和其與水凝膠前體溶液的結(jié)合方式克服這些問題。通過與多材料打印相結(jié)合，制造成型精度更高，穩(wěn)定性更好的人工3D組織模型。

參考文獻(xiàn)：
Ryma, M., Genç, H., Nadernezhad, A., Paulus, I., Schneidereit, D., Friedrich, O., Andelovic, K., Lyer, S., Alexiou, C., Cicha, I., Groll, J., A Print-and-Fuse Strategy for Sacrificial Filaments Enables Biomimetically Structured Perfusable Microvascular Networks with Functional Endothelium Inside 3D Hydrogels. Adv. Mater. 2022, 34, 2200653. https://doi.org/10.1002/adma.202200653