脫細(xì)胞基質(zhì)水凝膠的生物制造技術(shù)及其應(yīng)用

來源：生物打印與再生工程

脫細(xì)胞基質(zhì)（Decellularized matrix，dECM）水凝膠是一種具有與天然組織器官近似復(fù)雜生化信號分子的親水三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，被認(rèn)為是組織器官修復(fù)/制造的理想材料。其主要成分包括蛋白質(zhì)、糖胺聚糖、蛋白聚糖等，可以支持細(xì)胞3D培養(yǎng)、提供生化物理信號并與細(xì)胞動態(tài)互惠。近年來，該材料的成型加工是研究的熱點(diǎn)之一，本專題主要總結(jié)了脫細(xì)胞基質(zhì)在低維和三維結(jié)構(gòu)的生物制造手技術(shù)與應(yīng)用。

一、dECM的低維結(jié)構(gòu)制造
研究表明dECM可為細(xì)胞重建組織特異性的細(xì)胞微環(huán)境，促進(jìn)細(xì)胞功能成熟，因此常作為提高細(xì)胞生物相容性、調(diào)節(jié)細(xì)胞行為的功能性材料在低維結(jié)構(gòu)中發(fā)揮重要作用。

1. Journal of Materials Chemistry B 2018：dECM涂層技術(shù)【1】
簡介：
韓國浦項(xiàng)科技大學(xué)Dong-woo cho教授團(tuán)隊(duì)將豬脛骨前肌組織經(jīng)1%十二烷基硫酸鈉（SDS）、50U/ml DNAse、1U/ml RNAse和0.5%Triton X-100處理后制備得到肌肉脫細(xì)胞基質(zhì)（mdECM），并溶解于含胃蛋白酶的0.5M醋酸中得到水凝膠前體（Pre-gel）。Pre-gel經(jīng)中和后涂敷在由X射線LIGA技術(shù)制造的正弦波狀（20、40、80mm）聚苯乙烯結(jié)構(gòu)表面形成凝膠涂層，種植小鼠C2C12細(xì)胞培養(yǎng)7天后，評估肌管的形成情況。結(jié)果顯示間距為80mm的正弦波狀表面上觀察到排列良好的肌管，并接近天然肌纖維的寬度（~100 mm）。dECM涂層表面細(xì)胞粘附、細(xì)胞活力、肌管形成和肌源性基因表達(dá)（提高1.5-2倍）水平顯著高與膠原蛋白涂層。

2.  Composites Part B: Engineering 2022：dECM靜電紡絲膜制造技術(shù)【2】
簡介：
由于骨膜脫細(xì)胞基質(zhì)（pdECM）的形狀、完整性、均勻性和尺寸的控制難度較高，不能為臨床骨缺損修復(fù)提供適合的治療�；�于此，廣東省人民醫(yī)院口腔科周苗教授團(tuán)隊(duì)把pdECM粉末溶解在六氟異丙醇中，利用同軸靜電紡絲將聚己內(nèi)酯（PCL）/pdECM復(fù)合制備出具有骨膜特異性生化信號分子和定制物理化學(xué)特性的組織工程骨膜（TEP）以促進(jìn)骨缺損愈合。結(jié)果表明TEP具有良好的生物降解率，可避免感染、重建失敗和影響新生組織長入等問題。與純PCL相比，TEP可促進(jìn)hBMDCs的增殖、基質(zhì)成熟及成骨分化。與純ECM相比，PCL核心可提供TEP較好的機(jī)械強(qiáng)度促進(jìn)細(xì)胞的成骨分化并延長降解速率。

3. Macromolecular Bioscience 2022：dECM噴霧技術(shù)【3】
簡介：
安卡拉大學(xué)Burak Derkus教授團(tuán)隊(duì)利用噴霧技術(shù)將骨脫細(xì)胞基質(zhì)（bdECM）水凝膠前體溶液噴涂在聚己二酸/對苯二甲酸丁二醇酯（PBAT）電紡膜上，置37℃孵育1h后取出電紡膜并清理多余的dECM材料。將人胎兒成骨細(xì)胞（hFOBs）種植在電紡膜表面，觀察細(xì)胞行為。結(jié)果顯示纖維定向排布并且噴涂dECM的PBAT電紡膜表面hFOBs的骨相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)。

二、dECM的三維結(jié)構(gòu)制造
目前生物3D打印技術(shù)是dECM三維結(jié)構(gòu)制造的主流方式，以宏觀構(gòu)建仿生組織器官。但由于dECM凝膠時間長且成膠后機(jī)械性能較差，研究人員在3D打印過程中通過制造裝置改進(jìn)、制造工藝優(yōu)化、制造原料加工等方式提高了dECM的打印性和打印后的形狀保真度。

1. 制造裝置改進(jìn)
（1）Scientific Reports 2017【4】：改進(jìn)3D打印機(jī)加熱裝置
簡介：
韓國理工大學(xué)Jin-Hyung Shim教授團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種帶雙重加熱模塊的3D細(xì)胞打印系統(tǒng)，用于實(shí)時加熱交聯(lián)皮膚dECM（sdECM）生物墨水，實(shí)驗(yàn)表明sdECM水凝膠的黏度、模量及可打印性隨濃度的提高而增加，而水凝膠孔隙大小與細(xì)胞活力隨濃度升高而降低。當(dāng)噴頭和底板同時加熱，sdECM的打印性顯著提高，其中2%sdECM與2.5%sdECM的形狀保真度無顯著性差異，且同時加熱打印得到的3D結(jié)構(gòu)機(jī)械性能優(yōu)于其他組。但長期加熱打印會導(dǎo)致墨水干燥，會嚴(yán)重影響細(xì)胞活性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

（2）Macromolecular Bioscience 2018【5】：預(yù)升溫dECM交聯(lián)后打印
簡介：
薩班奇大學(xué)Bahattin Koc教授團(tuán)隊(duì)開發(fā)了牛跟腱dECM生物墨水，對比了不同增溶時間對dECM水凝膠模量、黏度的影響。打印時先將dECM水凝膠置37℃預(yù)熱6分鐘，然后采用微毛細(xì)管移取dECM水凝膠進(jìn)行擠出打印，打印過程中無任何支持結(jié)構(gòu)和/或額外的交聯(lián)劑。該方法打印出的dECM微絲形狀保真度較好，但層與層之間可能存在打印滯后及連接強(qiáng)度等問題。

2. 制造工藝優(yōu)化
（1）Advanced Science 2019【6】：以海藻酸鈉/黃原膠/葡萄糖內(nèi)酯材料為懸浮體系
簡介：
特拉維夫大學(xué)Tal Dvir教授團(tuán)隊(duì)將患者大網(wǎng)膜組織制備成dECM生物墨水，但在打印尺寸較大、復(fù)雜度較高的結(jié)構(gòu)時發(fā)現(xiàn)dECM水凝膠弱機(jī)械性能難以支撐其重量，因此選用懸浮膠支撐dECM的3D結(jié)構(gòu)，該懸浮膠主要由黃原膠和海藻酸鈉微粒組成，且內(nèi)部添加培養(yǎng)基。作為概念驗(yàn)證，他們設(shè)計(jì)了帶主要血管的心臟簡易結(jié)構(gòu)，打印出的心臟結(jié)構(gòu)完整性較好，可灌注，機(jī)械性能與脫細(xì)胞小鼠心臟無顯著性差異，打印結(jié)構(gòu)切片染色顯示心肌結(jié)構(gòu)及血管結(jié)構(gòu)內(nèi)部均勻分布心肌細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞。

（2）Bioactive Materials 2022【7】：熱塑性材料支撐dECM打印成形
簡介：
韓國浦項(xiàng)科技大學(xué)Dong-woo cho教授團(tuán)隊(duì)利用3D細(xì)胞打印和骨/肌腱dECM生物墨水模擬肌腱-骨界面（TBI）制備了梯度多組織界面構(gòu)建物。這些界面構(gòu)建物在結(jié)構(gòu)、成分和細(xì)胞異質(zhì)性方面具有與天然TBI相似的梯度特征。打印時先成形PCL/PU聚合物支架，后將dECM生物墨水選擇性沉積在聚合物支架表面，逐層打印獲得8*3*1mm3的尺寸結(jié)構(gòu)，然后進(jìn)行體內(nèi)外性能評估。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表面該界面構(gòu)建物在重建梯度界面和肩關(guān)節(jié)功能恢復(fù)方面具有優(yōu)勢，具有功能性肩袖再生的應(yīng)用前景。

3. 制造原料加工
（1）Biomaterials 2016【8】：直接加工——核黃素修飾
簡介：
無顯著性差異，打印結(jié)構(gòu)切片染色顯示心肌結(jié)構(gòu)及血管結(jié)構(gòu)內(nèi)部均勻分布心肌細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞。韓國浦項(xiàng)科技大學(xué)Dong-woo cho教授團(tuán)隊(duì)開發(fā)了兩步法，使用維生素B2誘導(dǎo)的UVA交聯(lián)和熱凝膠固化心肌dECM生物墨水，使dECM 3D打印生物結(jié)構(gòu)成為可能。打印的生物結(jié)構(gòu)內(nèi)部細(xì)胞活力較高和且心臟祖細(xì)胞在內(nèi)部可增殖分化。



（2）Biofabrication 2021【9】：直接加工——甲基丙烯酸化修飾
簡介：
俄勒岡健康與科學(xué)大學(xué)Luiz E Bertassoni副教授團(tuán)隊(duì)合成了一種可光交聯(lián)的人骨源性dECM水凝膠，以用于血管化支架的生物打印。他們將人骨碎片脫礦和脫細(xì)胞，獲得骨dECM水凝膠前體，用甲基丙烯酸酐進(jìn)一步處理修飾，獲得光交聯(lián)甲基丙烯酸化骨dECM水凝膠生物材料（BoneMA）。BoneMA具有可調(diào)諧的力學(xué)性能，其彈性模量隨著光交聯(lián)時間的增加而增加，同時保留了聚合物網(wǎng)絡(luò)的納米尺寸特征。3D打印的BoneMA支架支持內(nèi)皮細(xì)胞的血管化，并在一天內(nèi)形成相互連接的血管網(wǎng)絡(luò)。此外，他們利用數(shù)字光處理（DLP）打印技術(shù)展示了BoneMA在微尺度的可打印性。

（3）Advanced Functional Materials 2021【10】：直接加工——釕/過硫酸鈉修飾
簡介：
韓國浦項(xiàng)科技大學(xué)Jinah Jang助理教授團(tuán)隊(duì)介紹了新型含釕/過硫酸鈉（dERS）的光固化dECM生物墨水。利用dECM內(nèi)含豐富的酪氨酸殘基的優(yōu)勢，使其在可見光范圍（400-450nm）實(shí)現(xiàn)快速交聯(lián)，該光引發(fā)劑的使用濃度低，可防止紫外光誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)DNA損傷，高滲透效率也有利于大尺寸結(jié)構(gòu)的整體固化。該光固化體系在dECM生物墨水中具有巨大應(yīng)用潛力，有效提高dECM生物墨水的打印精度和形狀保真度。

（4）Polymers 2019【10】：間接加工——混合甲基丙烯酸化聚氨酯
簡介：
中國醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院3D打印醫(yī)學(xué)研究中心謝明佑助理教授團(tuán)隊(duì)利用DLP技術(shù)制備了聚氨酯/聚多巴胺/細(xì)胞外基質(zhì)（PU/PDA/dECM）神經(jīng)導(dǎo)管，并評估了其物理特性、生物降解性、細(xì)胞相容性、神經(jīng)相關(guān)生長因子、蛋白的分泌和表達(dá)，以及其在允許細(xì)胞粘附和增殖方面的潛力。結(jié)果表明，PU/PDA/dECM神經(jīng)導(dǎo)管具有更強(qiáng)的親水性，可促進(jìn)細(xì)胞粘附、增殖、表達(dá)和分泌神經(jīng)相關(guān)蛋白（I型膠原和層粘連蛋白），也可以增強(qiáng)神經(jīng)源性蛋白的表達(dá)，如巢蛋白和微管相關(guān)蛋白2（MAP2）。此外，PU/PDA/ECM神經(jīng)導(dǎo)管無細(xì)胞毒性，具有持續(xù)的生物降解性，并具有與PU導(dǎo)管相似的物理特性。因此，PU/PDA/ECM神經(jīng)導(dǎo)管可能成為未來神經(jīng)相關(guān)研究或臨床應(yīng)用的潛在候選材料。

（5）Applied Physics Reviews 2019【11】：間接加工——海藻酸鈉/普朗尼克
簡介：
韓國浦項(xiàng)科技大學(xué)Dong-woo cho教授團(tuán)隊(duì)利用血管來源dECM生物墨水和儲蓄庫輔助的三同軸細(xì)胞打印技術(shù)構(gòu)建了血管移植物，該移植物尺寸大小與冠狀動脈相似，并含有異質(zhì)細(xì)胞分布，制備后移植入大鼠腹主動脈處探究其作為人工血管的可行性，結(jié)果表明所有植入物均顯示出良好的通暢度、完整的內(nèi)皮層、重塑的平滑肌和與宿主組織高匹配度。

（6）Acta Biomaterialia 2021【12】：間接加工——明膠/透明質(zhì)酸/甘油輔助成型
簡介：
維克森林大學(xué)再生醫(yī)學(xué)研究所Sang Jin Lee教授團(tuán)隊(duì)分離豬耳廓軟骨組織并進(jìn)行脫細(xì)胞處理，隨后利用甲基丙烯酸酐（cdECMMA）加工成光交聯(lián)水凝膠，并與明膠/透明質(zhì)酸/甘油混合提高其打印性，最后與軟骨細(xì)胞混合以創(chuàng)建生物墨水。結(jié)果表明該混合生物墨水打印后的3D結(jié)構(gòu)具有足夠的力學(xué)性能和結(jié)構(gòu)完整性，并且耳廓軟骨細(xì)胞保持了活力、增殖能力且產(chǎn)生軟骨ECM成分，包括膠原蛋白和糖胺聚糖（GAGs）。

（7）Biomaterials 2022【13】：間接加工——PVA輔助產(chǎn)生對齊/定向纖維
簡介：
維克森林大學(xué)再生醫(yī)學(xué)研究所Geun Hyung Kim教授團(tuán)隊(duì)使用了脫細(xì)胞外基質(zhì)（dECM）作為誘導(dǎo)細(xì)胞生化組分，并改進(jìn)3D細(xì)胞打印過程，利用PVA輔助產(chǎn)生單軸對齊/定向纖維結(jié)構(gòu)。打印結(jié)構(gòu)中的成肌細(xì)胞與形成的肌管結(jié)構(gòu)高度對齊，與基于甲基丙烯酸明膠（GelMA）的結(jié)構(gòu)相比， dECM結(jié)構(gòu)內(nèi)基因表達(dá)水平增加了約1.5-1.8倍。

總結(jié)與展望
目前，脫細(xì)胞基質(zhì)水凝膠已經(jīng)過I期臨床實(shí)驗(yàn)證明其生物安全性良好【14】，大量研究也證明其對細(xì)胞特異性分化的促進(jìn)作用，有望成為組織再生和修復(fù)的優(yōu)異材料。但其機(jī)械性能和成型能力限制了廣泛應(yīng)用，本篇文章旨在總結(jié)優(yōu)化脫細(xì)胞基質(zhì)成型加工能力的技術(shù)手段，調(diào)研結(jié)果說明，與單一材料相比，多組分材料的成型加工能力可提升范圍更廣，且具有可調(diào)諧的機(jī)械性能，是未來dECM生物墨水在3D結(jié)構(gòu)構(gòu)建中的發(fā)展方向。

參考文獻(xiàn)
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