浙江大學(xué)&牛津大學(xué)團(tuán)隊(duì)：一種用于多交聯(lián)方式多材料嵌入式打印的支持浴

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嵌入式生物三維打印技術(shù)將二維打印平臺(tái)轉(zhuǎn)移到三維支持浴中，以三維支持浴向打印的材料提供支撐，消除了傳統(tǒng)擠出式生物3D打印對(duì)生物墨水機(jī)械性能的要求，由此解決了生物墨水可打印性和生物相容性之間的矛盾。然而，現(xiàn)有的支持浴在打印窗口、與生物墨水或交聯(lián)劑的兼容性以及支持浴的去除等方面存在局限性，極大程度上限制了多交聯(lián)方式、多材料打印的研究，使異質(zhì)組織/器官的構(gòu)建更為困難。近日，浙江大學(xué)機(jī)械工程學(xué)院楊華勇院士團(tuán)隊(duì)和牛津大學(xué)崔占峰院士團(tuán)隊(duì)合作在Biofabrication（影響因子11.061）發(fā)表題為“A Versatile Embedding Medium for Freeform Bioprinting with Multi-Crosslinking Methods”的文章，基于疏水改性的羥丙基甲基纖維素和Pluronic F-127間的疏水締合作用提出一種適用于多交聯(lián)方式、多材料通用型支持浴，能夠兼容光交聯(lián)、pH交聯(lián)、離子交聯(lián)、酶交聯(lián)及溫度交聯(lián)等交聯(lián)方式，實(shí)現(xiàn)多交聯(lián)方式多材料在同一支持浴內(nèi)的同步構(gòu)建。本文的通訊作者為浙江大學(xué)機(jī)械工程學(xué)院周竑釗副研究員與牛津大學(xué)工程科學(xué)系葉華副教授。

背景介紹
在傳統(tǒng)擠出式生物打印過程中，生物墨水的可打印性與其生物相容性存在矛盾，墨水需要較高材料剛度才能在重力作用下保持特定的三維結(jié)構(gòu)，然而，較高的材料剛度通常會(huì)降低細(xì)胞功能，例如細(xì)胞粘附、遷移和增殖等，同樣的，具有良好生物相容性的軟材料通常缺乏可打印性，使其難以成形。將支持介質(zhì)從空氣改為支持浴，以在生物墨水固化之前將其保持在原位是一種新興的打印方法，稱為嵌入式打印。目前已經(jīng)有多種支持浴材料被開發(fā)出來(lái)，并用于復(fù)雜三維結(jié)構(gòu)的打印。但是由于目前支持浴在打印窗口大小、對(duì)生物墨水或交聯(lián)劑的兼容、支持浴去除、生物相容性等方面存在局限性，限制了多交聯(lián)方式多材料在支持浴內(nèi)的生物組織模型構(gòu)建，進(jìn)而使異質(zhì)組織/器官的體外構(gòu)建更為困難。

因此，研究團(tuán)隊(duì)針對(duì)多交聯(lián)方式多材料在支持浴內(nèi)的構(gòu)建難題，基于疏水改性的羥丙基甲基纖維素和Pluronic F-127間的疏水締合作用，提出了一種具有可調(diào)的打印窗口、兼容大多數(shù)生物墨水和交聯(lián)劑、可方便去除的支持浴材料。在研究了該材料的流變特性、穩(wěn)定性和可打印性后，構(gòu)建了不同具有分支的管狀結(jié)構(gòu)，以評(píng)估打印精度、支持浴的可洗脫性和生物相容性，并利用該支持浴材料支撐光交聯(lián)、pH交聯(lián)、離子交聯(lián)、酶交聯(lián)及溫度交聯(lián)等交聯(lián)方式在支持浴內(nèi)的復(fù)雜結(jié)構(gòu)構(gòu)建，此外，還實(shí)現(xiàn)了多交聯(lián)方式多材料在同一支持浴內(nèi)的同步構(gòu)建。進(jìn)一步的，作者還提出一種基于支持浴溫敏特性的界面增強(qiáng)打印方法，能夠適用于多種交聯(lián)方式的軟材料打印，提高層間連接強(qiáng)度。

圖1 支持浴內(nèi)多交聯(lián)方式多材料打印方法及材料原理示意圖

實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1. 支持浴材料流變性能
利用疏水改性的羥丙基甲基纖維素和Pluronic F-127間的疏水締合作用可以構(gòu)建出具有可調(diào)屈服應(yīng)力的支持浴材料，因此，作者檢測(cè)了5-15% Pluronic F-127結(jié)合2-4%羥丙基甲基纖維素的流變特性，通過溫度掃描、剪切速率掃描、頻率掃描、觸變性掃描等測(cè)試，作者發(fā)現(xiàn)支持浴的屈服應(yīng)力可以通過兩種材料間的相對(duì)濃度進(jìn)行調(diào)控，在室溫（26 ℃）下支持浴的屈服應(yīng)力可以在0.59-91.11 Pa之間任意調(diào)控。作者在支持浴中加入聚乙二醇后，通過改變支持浴中Pluronic F-127與水分子間的水合作用，可以顯著降低材料體系的黏度，這使得支持浴材料的洗脫更為便捷。進(jìn)一步的作者在支持浴中加入酶、離子和氫氧化鈉以驗(yàn)證其對(duì)多種交聯(lián)劑的兼容性，在加入不同交聯(lián)劑后，復(fù)合支持浴材料體系依舊擁有一定的屈服應(yīng)力與良好的觸變性，能夠?yàn)槎嘟宦?lián)方式多材料打印提供打印平臺(tái)。

圖2 支持浴材料流變性能

2. 支持浴內(nèi)打印穩(wěn)定性與精度
為了探究在支持浴內(nèi)進(jìn)行嵌入式打印的穩(wěn)定性與打印精度，作者首先使用了粒子圖像測(cè)速法（PIV）對(duì)不銹鋼圓柱針頭在支持浴內(nèi)移動(dòng)所產(chǎn)生的速度場(chǎng)進(jìn)行探究，對(duì)比不同支持浴屈服應(yīng)力、針頭直徑和移動(dòng)速度對(duì)移動(dòng)方向平行、垂直的兩個(gè)方向的速度場(chǎng)擾動(dòng)的影響，更大屈服應(yīng)力的支持浴材料能夠提供更穩(wěn)定的流場(chǎng)，其速度擾動(dòng)收斂的越快，此外，針頭直徑和移動(dòng)速度對(duì)歸一化后的速度場(chǎng)擾動(dòng)無(wú)顯著影響。其次，作者在支持浴內(nèi)以不同的速度和擠出壓力打印甲基丙烯酸化明膠（GelMA）,獲得了膨脹、相等、拉伸表現(xiàn)的規(guī)則線條以及堆積、破裂的不規(guī)則線條，為了優(yōu)化打印精度，作者針對(duì)相等的規(guī)則線條進(jìn)行進(jìn)一步探究，其線條表面粗糙度表現(xiàn)良好，直徑波動(dòng)小于10%，直徑可以依據(jù)質(zhì)量守恒定律通過氣壓進(jìn)行預(yù)測(cè)。因此，該支持浴材料可以通過改變流變特性提供較好的穩(wěn)定性，改變氣壓和移動(dòng)速度可以預(yù)測(cè)、優(yōu)化打印直徑，提高打印精度。

圖3 支持浴的穩(wěn)定性及在支持浴內(nèi)打印精度研究

3. 具有分支的復(fù)雜管狀結(jié)構(gòu)構(gòu)建
為了驗(yàn)證支持浴材料能提供的打印精度及其生物相容性，作者在支持浴內(nèi)打印了具有不同分支特征的管狀結(jié)構(gòu)，在經(jīng)歷嵌入式打印、洗脫等步驟后，作者在具有不同特征的管狀結(jié)構(gòu)（不同分叉角的Y管結(jié)構(gòu)，分叉-匯合結(jié)構(gòu)，二分叉結(jié)構(gòu)）內(nèi)通入帶有熒光粒子和染料的PBS溶液，溶液可以順利的從入口流到出口，這一結(jié)果表明打印的結(jié)構(gòu)具有完整性和通透性。進(jìn)一步的，作者對(duì)比了在支持浴打印的管狀結(jié)構(gòu)與在空氣中打印的管狀結(jié)構(gòu)，空氣中打印的管狀結(jié)構(gòu)在生物墨水的溫敏特性和打印平臺(tái)、環(huán)境溫度的作用下，無(wú)法保持均一的管狀結(jié)構(gòu)，呈現(xiàn)上窄下寬的特征，與之相反，在支持浴內(nèi)打印的管狀結(jié)構(gòu)其管徑均一。檢測(cè)兩種方法打印的管狀物的細(xì)胞行為，無(wú)顯著的存活率、細(xì)胞形態(tài)和增殖能力的變化。綜上所述，所提出的支持浴材料能夠滿足高精度復(fù)雜三維組織的體外構(gòu)建，并且有較好的生物相容性。

圖4 支持浴內(nèi)復(fù)雜管狀結(jié)構(gòu)構(gòu)建及其灌注結(jié)果

圖5 支持浴生物相容性實(shí)驗(yàn)

4. 多交聯(lián)方式多材料支持浴內(nèi)同步構(gòu)建
論文所提出的支持浴材料體系基于疏水改性的羥丙基甲基纖維素與Pluronic F-127疏水締合作用，通過Pluronic F-127與水的氫鍵進(jìn)行支持浴屈服應(yīng)力的調(diào)節(jié)，因此，在不具有強(qiáng)親水、強(qiáng)疏水作用的添加物作用下，支持浴的屈服應(yīng)力和觸變性不會(huì)發(fā)生顯著變化。繼而作者在支持浴內(nèi)打印GelMA、明膠、海藻酸鈉、膠原、殼聚糖等材料以形成復(fù)雜三維結(jié)構(gòu)，在光照、溫度、酶、離子和pH等交聯(lián)因素的作用下，這些結(jié)構(gòu)能夠被交聯(lián)固化并且從支持浴中洗脫出來(lái)。進(jìn)一步的，在支持浴內(nèi)加入氯化鈣和膠原酶，同時(shí)打印GelMA、海藻酸鈉、明膠等生物墨水，能構(gòu)建出多交聯(lián)方式多材料復(fù)雜三維結(jié)構(gòu)。

圖6 多交聯(lián)方式多材料在支持浴內(nèi)的構(gòu)建

5. 支持浴內(nèi)構(gòu)建界面連接增強(qiáng)的軟材料三維結(jié)構(gòu)
在Pluronic F-127中PEG基團(tuán)的影響下，支持浴材料的黏度隨著溫度的上升而上升，而GelMA、明膠等生物墨水的黏度隨著溫度的上升而下降，因此，利用支持浴與生物墨水間相反的溫敏特性，作者提出了一種界面連接增強(qiáng)的制造方式。在支持浴內(nèi)完成生物墨水打印后，將整體放置于較高溫度下十分鐘，使生物墨水的黏度下降而有利于層間溶液，與此同時(shí)，支持浴的黏度上升，這防止了生物墨水的外溢。該打印方法能夠顯著增強(qiáng)GelMA、明膠等溫敏材料的層間黏合強(qiáng)度，為解決3D打印固有的層間黏合強(qiáng)度差的問題提供一種解決方案。

圖7 基于支持浴內(nèi)嵌入式打印的界面增強(qiáng)打印方法

總結(jié)
本研究提出了一種基于水改性的羥丙基甲基纖維素和Pluronic F-127間的疏水締合作用的支持浴材料，該材料由于組分間結(jié)合方式，能夠在多種無(wú)強(qiáng)疏水和強(qiáng)親水交聯(lián)劑的作用下保持屈服應(yīng)力和觸變特性，因此能兼容多種生物墨水和交聯(lián)劑，此外，在聚乙二醇的作用下該支持浴材料的黏度會(huì)被顯著降低，由此方便其洗脫過程。該支持浴材料能夠提供較好的嵌入式打印穩(wěn)定性和打印精度，并且具有較高的生物相容性。此外，基于該材料的通用型，作者在支持浴內(nèi)打印了GelMA、明膠、海藻酸鈉、膠原、殼聚糖等材料，通過光交聯(lián)、pH交聯(lián)、離子交聯(lián)、酶交聯(lián)及溫度交聯(lián)等交聯(lián)方式進(jìn)行固化，實(shí)現(xiàn)體外多交聯(lián)方式多材料同步構(gòu)建。本研究所提出的支持浴材料能夠?yàn)槎嗖牧蠌?fù)雜三維組織/器官的體外構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。

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https://iopscience.iop.org/article/10.1088/1758-5090/ac7909