浙江大學(xué)王毅及賀永團隊：生物水凝膠微結(jié)構(gòu)快速制造方法助力心肌細胞定向可控生長

來源：EngineeringForLife  

生物水凝膠上的微/納米結(jié)構(gòu)廣泛用于誘導(dǎo)細胞圖案化。傳統(tǒng)的光刻技術(shù)制造模具既耗時又昂貴，并且由于生物水凝膠軟脆的特性，過大的脫模力還極易導(dǎo)致微結(jié)構(gòu)損壞。近期，EFL團隊與藥學(xué)院王毅教授合作提出了一種快速批量制造細胞圖案的新方法，使用高精度3D打印模具，通過揭示熱-光交聯(lián)固化機制，實現(xiàn)低濃度-低取代率的GelMA水凝膠微結(jié)構(gòu)高質(zhì)高效制造。利用該方法，可以穩(wěn)定且低成本地制造特征尺寸為6-80μm任意定制的水凝膠圖案。在超軟水凝膠及高精度微結(jié)構(gòu)的支持下，心肌細胞可實現(xiàn)每分鐘216次（BPM）的持續(xù)自發(fā)搏動，接近大鼠心臟的自然搏動速率（300 BPM）。這項工作為細胞圖案化提供了一個通用方案，能廣泛應(yīng)用于組織修復(fù)、藥物測試篩選等領(lǐng)域。相關(guān)工作“Rapid and mass manufacturing of soft hydrogel microstructures for cell patterns assisted by 3D printing”近期發(fā)表在Bio-Design and Manufacturing雜志上，浙大機械學(xué)院何超凡博士生與浙大藥學(xué)院王雪純博士為共同一作，浙大機械學(xué)院的賀永教授和藥學(xué)院的王毅教授為共同通訊作者。

材料與細胞的相互作用是組織工程和再生醫(yī)學(xué)的研究熱點之一。除了生化特性，材料表面的拓撲結(jié)構(gòu)對細胞行為也有重要影響。許多研究表明，接近細胞大小的微/納米結(jié)構(gòu)對細胞具有“接觸引導(dǎo)”效應(yīng)，即細胞的生長方向與該結(jié)構(gòu)趨于一致，這一效應(yīng)已在許多細胞中得到驗證。然而，現(xiàn)有的細胞-基質(zhì)相互作用研究大多基于生物相容性較差的材料，如聚二甲基硅氧烷（PDMS）、硅、石英等，其主要原因是高效高質(zhì)制造軟脆水凝膠微結(jié)構(gòu)仍然是一個很大的挑戰(zhàn)，低濃度-低取代率的水凝膠更是如此。本文采用高精度DLP打印工藝制造了超精密結(jié)構(gòu)的模具，并翻模出軟的PDMS模具，與光刻技術(shù)相比設(shè)計靈活性及效率有較大提升。將GelMA溶液澆鑄在模具上進行熱-光交聯(lián)，與光交聯(lián)GelMA (PGelMA)相比，熱光交聯(lián)GelMA (TPGelMA)在保持良好的生物相容性、降解性和可調(diào)性的同時，更有彈性。其核心的機制是隨著溫度的降低，三螺旋結(jié)構(gòu)（THS）的部分恢復(fù)會導(dǎo)致GelMA的溶液-凝膠化轉(zhuǎn)變。熱光交聯(lián)的凝膠TPGelMA，其力學(xué)性能的提高能大幅降低脫模過程中微結(jié)構(gòu)的破壞。

圖1 軟脆水凝膠微結(jié)構(gòu)制造方法

為驗證三螺旋結(jié)構(gòu)（THS）對GelMA水凝膠性能的影響，比較了EFL-GM30、GM60、GM90三種典型取代率GelMA的CD光譜。這三條線在198 nm附近都有一個負峰，與膠原蛋白類似。峰幅值隨著取代率的增加而減小，說明MA基團的引入破壞了明膠鏈上原有的氨基酸序列，阻礙了THS的形成。GM30在不同溫度下的CD光譜也顯示，隨著溫度的降低，促進了THS的形成。FTIR分析顯示，TPGelMA光譜的峰值更高，頻率也發(fā)生了顯著變化，這與氫鍵數(shù)量的增加密切相關(guān)。在機械強度方面，TPGelMA的楊氏模量和抗拉強度均明顯高于PGelMA。隨著取代率的增加，強度增加比逐漸降低，說明MA基團的引入阻礙了THS的形成，這與CD光譜的結(jié)果一致。兩種GelMA在不同溶劑中的體積變化率也不同。結(jié)果表明，TPGelMA在去離子水、PBS溶液和75%乙醇溶液中的體積變化明顯小于PGelMA，表明TPGelMA的分子網(wǎng)絡(luò)更致密。

圖2 熱-光交聯(lián)水凝膠的性能

水凝膠潮濕、軟脆的特性使其力學(xué)數(shù)據(jù)難以準(zhǔn)確測量。到目前為止，對水凝膠力學(xué)性能的研究大多僅限于壓縮試驗上。為解決這一問題，我們設(shè)計了一系列實驗方案，以準(zhǔn)確獲取水凝膠拉伸、壓縮、剪切、黏附等各種力學(xué)數(shù)據(jù)。并在此基礎(chǔ)上，建立了水凝膠在脫模過程中的粘附和損傷模型。拉伸試驗結(jié)果表明，TPGelMA的楊氏模量、抗拉強度和斷裂伸長率顯著提高。當(dāng)應(yīng)變達到200%后，應(yīng)力-應(yīng)變曲線斜率明顯增大，為“應(yīng)變硬化”效應(yīng)。這種現(xiàn)象并沒有發(fā)生在PGelMA中。在整個拉伸過程中，PGelMA的應(yīng)力-應(yīng)變曲線始終是線性的。這可能是因為其分子網(wǎng)絡(luò)比較松散，在分子鏈取向趨于一致之前就斷裂了。在剪切實驗中，TPGelMA也表現(xiàn)出更好的力學(xué)性能。而在粘附實驗中，TPGelMA的粘附強度雖然也有所增加，但增加幅度遠低于拉伸和剪切強度的增加幅度，這也是TPGelMA能避免脫模損傷的重要原因。

圖3 水凝膠機械性能測試方案與損傷模型

我們設(shè)計了平行凹槽、封閉圓環(huán)、曲線、分叉血管和10um-5mm的跨尺度結(jié)構(gòu)以驗證制備方案的可行性。結(jié)果表明TPGelMA的制作完整，而PGelMA上的微結(jié)構(gòu)受損嚴重，難以分辨。在一個PDMS模具上反復(fù)多次脫模后模具上沒有殘留。因此，該方案脫模后無需清洗，大大縮短了工藝流程。為了對工藝窗口進行全面分析，選擇力學(xué)性能依次提高但生物性能降低的GM30 ~ GM5M進行脫模試驗。結(jié)果表明，TPGelMA在最低濃度，結(jié)構(gòu)復(fù)雜度，深寬比三個方面的工作窗口都明顯拓寬。

圖4 水凝膠微結(jié)構(gòu)的制造

熱光交聯(lián)可以最大程度地保持明膠基水凝膠的生物相容性，同時提高其機械強度。這是因為膠原蛋白分子鏈上的細胞粘附位點沒有被破壞。為了驗證這一點，將心肌細胞、肌腱干細胞和成纖維細胞接種于PGelMA和TPGelMA上，并在第3天進行活死分析。結(jié)果表明，不同的細胞對兩種水凝膠均有良好的生物活性。為了驗證微圖紋水凝膠對細胞的接觸引導(dǎo)作用，用肌腱干細胞構(gòu)建了平行條紋圖，用心肌細胞構(gòu)建了環(huán)形圖。可以看到細胞按照設(shè)計的圖案排列，細胞骨架也沿著微結(jié)構(gòu)的方向生長。而脫模失敗的水凝膠則很難使細胞形成圖案。

圖5 生物相容性和細胞圖案化效果

在水凝膠上的細胞圖案更符合體內(nèi)微環(huán)境。分析心肌細胞的跳動及功能蛋白表達。對照組心肌細胞無序生長，隨機分布，細胞之間的連接也非常混亂。相比之下，實驗組心肌細胞排列更有規(guī)律，掃描電子顯微鏡也清楚地顯示，細胞連接形成一個更有序的網(wǎng)絡(luò)。利用視頻分析軟件ImageJ對心肌細胞的跳動進行分析，發(fā)現(xiàn)對照組的跳動速度為24 BPM，比機體的跳動速度慢一個數(shù)量級。實驗組心肌細胞的搏動速度為216 BPM。實驗組不僅細胞的搏動速度提高了10倍，而且搏動一致性提高了很多。對照組細胞收縮時間、峰-峰時間、峰間時間、松弛時間更長。而且數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)差很大，說明細胞跳動的規(guī)律性很差。在實驗組中，細胞跳動數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)差降低為十分之一左右。這表明，細胞不僅跳動得更快，而且跳動得更有規(guī)律。肌節(jié)α肌動蛋白染色分析顯示，圖案化心肌細胞具有肌節(jié)結(jié)構(gòu)，隨細胞縱向分布，這更符合生物體的實際情況。相比之下，對照組的肌動蛋白是無序的。這表明圖案心肌細胞在結(jié)構(gòu)和功能上更接近生物體的真實狀態(tài)，對理解細胞行為和構(gòu)建人工生物組織具有重要的啟發(fā)意義。軟脆水凝膠微結(jié)構(gòu)制備方法在組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有重要的潛力，為仿生組織、芯片上器官、細胞行為學(xué)和微流體提供了一個通用的平臺。

圖6 圖案化細胞的功能性

文章來源：
https://link.springer.com/article/10.1007/s42242-022-00207-1