浙江大學(xué)賀永等 | 光固化生物3D打印教程之高精度水凝膠支架制造

來(lái)源：生物設(shè)計(jì)與制造BDM


本Technical Note聚焦光固化生物3D打印之高精度水凝膠支架制造。投影式光固化生物打印(Projection-based 3D bioprinting, PBP)具有精度高、速度快、自支撐等優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)在生物制造領(lǐng)域有越來(lái)越多PBP的成功應(yīng)用案例。然而，完全理解PBP的原理需要光學(xué)、高分子、工程、生物學(xué)等綜合學(xué)科的背景知識(shí)，初學(xué)者熟練掌握PBP的流程也需要經(jīng)歷長(zhǎng)時(shí)間的試錯(cuò)與經(jīng)驗(yàn)積累。降低PBP的入門(mén)使用門(mén)檻，可使更多研究者能從這項(xiàng)技術(shù)中受益。

本文給出了一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的水凝膠支架打印流程，我們將PBP生物支架打印分為“材料配制”、“支架打印”、“后處理”與“細(xì)胞接種”四個(gè)工序，給出了標(biāo)準(zhǔn)化的操作方法，整理了很多常見(jiàn)的問(wèn)題、技巧及背后機(jī)制。通過(guò)這篇教程，希望能夠幫助PBP初學(xué)者，降低非工程學(xué)科背景使用者在工藝測(cè)試上的時(shí)間和成本，將PBP作為得力工具加速其研究。


PBP工作流程

圖1 PBP操作流程圖（以EFL-8601打印機(jī)為例說(shuō)明）

1. 材料配制
介紹用于投影式光固化打印的GelMA光敏水凝膠的組成成分、配比、配制方法、儲(chǔ)存方法、各成分打印的功能機(jī)理。與常規(guī)三維細(xì)胞培養(yǎng)不同的是在材料中添加了可以降低打印誤差的吸光劑。除標(biāo)準(zhǔn)化流程外，特別強(qiáng)調(diào)了兩個(gè)實(shí)用的小技巧：先使用冷溶劑潤(rùn)濕各成分后再加熱溶解，以及通過(guò)離心方法除去溶解后產(chǎn)生的大量微氣泡能夠顯著提升打印質(zhì)量。

2. 支架打印
因?yàn)橄嚓P(guān)打印設(shè)備的商業(yè)化，打印過(guò)程的設(shè)置已變得非常簡(jiǎn)便，而打印參數(shù)設(shè)置通常軟件里也配有推薦值，初學(xué)者可根據(jù)軟件提示一鍵打印。然而作者重點(diǎn)提示了兩個(gè)打印過(guò)程中常見(jiàn)的問(wèn)題：模型擺放方向與打印件脫落，闡釋了打印時(shí)間、x-y平面與z方向制造精度差異與模型擺放方向間的關(guān)系，介紹了采用打印原液對(duì)平臺(tái)涂底的防脫落實(shí)用技巧。

3. 后處理
后處理是很多熟悉PBP的研究者都容易忽略的過(guò)程，科學(xué)的后處理不僅可以大大延長(zhǎng)支架的儲(chǔ)存時(shí)間，而且能提升成品精細(xì)結(jié)構(gòu)精度與細(xì)胞粘附能力。后處理包括：清除剩余的未交聯(lián)材料、消毒、生物因子處理、凍干等標(biāo)準(zhǔn)步驟。

4. 細(xì)胞接種
與傳統(tǒng)培養(yǎng)皿或孔板中平面接種細(xì)胞不同，PBP打印的水凝膠支架通常具有復(fù)雜的三維形貌，為復(fù)雜的曲面接種細(xì)胞通常需要多角度多次接種。文中以空心管狀結(jié)構(gòu)為例，介紹了如何將內(nèi)腔鋪滿細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)化操作方法與其背后的原理。

實(shí)驗(yàn)案例

圖2 管狀支架應(yīng)用案例

管狀結(jié)構(gòu)廣泛存在于生物體內(nèi)，如血管、髓鞘、膽管等。作者按PBP標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行操作，并給出了各環(huán)節(jié)的具體參數(shù)。通過(guò)PBP打印支架再接種的方法能夠制造出含有單層均勻布滿內(nèi)腔的內(nèi)皮細(xì)胞層血管模型。

討論：載細(xì)胞打印 vs 支架接種細(xì)胞
如今載細(xì)胞打印技術(shù)也已非常成熟，為什么我們還需要先制造支架再進(jìn)行接種的分步方案？作者給出了以下兩點(diǎn)重要理由：

1. 空間分離避免成形性與生物性的矛盾
生物材料需要兼具生物性能與成形性能，但這兩者通常是矛盾的，優(yōu)異的生物性能需要多孔疏松的材料來(lái)降低對(duì)細(xì)胞的約束，提升物質(zhì)的交換，這勢(shì)必會(huì)降低交聯(lián)過(guò)程中交聯(lián)基團(tuán)間發(fā)生反應(yīng)的概率，降低成形性。這是細(xì)胞處于水凝膠內(nèi)部三維包裹時(shí)的情況，即載細(xì)胞打印時(shí)無(wú)法避免的問(wèn)題。然而，支架打印剝離了制造與細(xì)胞培養(yǎng)的過(guò)程，制造過(guò)程中無(wú)細(xì)胞，接種過(guò)程中細(xì)胞實(shí)際以二維鋪展?fàn)顟B(tài)粘附在三維支架表面。兩個(gè)過(guò)程不再彼此制約，從而可以制造出更加復(fù)雜的支架結(jié)構(gòu)用于搭載細(xì)胞。

2. 時(shí)間分離降低復(fù)雜度便于交叉合作
載細(xì)胞打印時(shí)，必須同時(shí)滿足材料、制造、細(xì)胞等前提條件，受到細(xì)胞活性的限制，整個(gè)過(guò)程必須在短時(shí)間內(nèi)完成。從研究者的實(shí)驗(yàn)角度考慮，這需要完整的材料、工程、生物因素同時(shí)在場(chǎng)，無(wú)疑在無(wú)形中大大提升了門(mén)檻。而支架打印完全可以提前做好支架并凍干保存，然后待細(xì)胞狀態(tài)合適時(shí)再進(jìn)行接種。這降低了完整流程的復(fù)雜度，提升了成功率，也方便不同學(xué)科間的交叉合作。