洞察組織生物打印最前沿！Cell重磅評述

來源： EngineeringForLife


工程化生物人工組織通常由細(xì)胞、生物材料和生物分子構(gòu)成，在醫(yī)學(xué)上有著廣泛應(yīng)用。 這些組織不僅可以用于了解疾病的形成和進(jìn)展，還可以用于開發(fā)生物替代品來修復(fù)或替換受損器官。此外，實驗室培養(yǎng)的組織也可用于開發(fā)人源化體外模型，以驗證藥物的安全性和有效性。生物打印結(jié)合了增材制造和組織工程來生成功能性組織和器官。

2022年7月21日發(fā)表在《Cell》上的一篇評述文章對組織生物打印的研究現(xiàn)狀做了總結(jié)和進(jìn)一步的展望，相關(guān)內(nèi)容以“Tissue bioprinting for biology and medicine”為題，作者是來自加州大學(xué)洛杉磯分校（UCLA）的Ali Khademhosseini教授和加拿大維多利亞大學(xué)的Mohsen Akbari教授。該評述重點介紹了生物打印領(lǐng)域的最新突破，并討論了在該技術(shù)廣泛應(yīng)用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)之前尚未解決的挑戰(zhàn)。

隨著新支架制造技術(shù)（如生物打印、程序化自組裝）的出現(xiàn)、具有細(xì)胞調(diào)節(jié)能力的新型生物材料的爆發(fā)、新型細(xì)胞來源的開發(fā)（例如，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞）、用于疾病建模和藥物篩選的器官芯片系統(tǒng)的引入以及基因編輯工具（例如，CRISPR-Cas9）的出現(xiàn)（圖1），組織工程領(lǐng)域在過去30年中取得了顯著進(jìn)展。

△組織工程的進(jìn)展

組織工程在不同方面取得了進(jìn)展。 迄今為止，可再生細(xì)胞來源、新型生物材料、能夠在細(xì)胞水平上控制組織微環(huán)境的小型化系統(tǒng)、創(chuàng)新的生物制造方法和基因編輯工具可用于創(chuàng)建具有類似于天然組織的結(jié)構(gòu)、組成和功能特性的組織模擬物。

盡管這些進(jìn)步預(yù)示著醫(yī)學(xué)的光明未來，但仍有許多障礙需要克服。首先，很難概括由不同長度尺度的多種不同細(xì)胞和材料組成的復(fù)雜活組織。第二個挑戰(zhàn)是在組織制造和成形過程中保持細(xì)胞活力和功能。最后，大規(guī)模組織制造需要可擴(kuò)展的方法，以便能夠在體外快速制造仿生工程組織。

生物打印為在三維空間中沉積細(xì)胞和生物活性分子提供了極大的靈活性，并且實現(xiàn)了自動化工作流程，從而最大限度地減少了對細(xì)胞的手動操作，提高了組織制造的可擴(kuò)展性以便進(jìn)行高通量藥物篩選。

△生物打印的進(jìn)步增強(qiáng)了組織擬態(tài)和細(xì)胞活力

這些進(jìn)步帶來了幾項技術(shù)創(chuàng)新，包括FRESH打印、多材料擠壓和基于光的打印、體積生物打印，以及具有改進(jìn)細(xì)胞相容性的新型顆粒生物墨水。

1. 增強(qiáng)組織擬態(tài)
每種組織都有其獨特的結(jié)構(gòu)（包括不同細(xì)胞類型和成分的排布等），以實現(xiàn)特定的功能。例如，心臟是由同步收縮的對齊纖維狀結(jié)構(gòu)構(gòu)成以實現(xiàn)泵血功能，而肝臟由六邊形結(jié)構(gòu)和大量的、纏繞在一起的血管網(wǎng)絡(luò)組成，負(fù)責(zé)過濾血液供應(yīng)中的有毒物質(zhì)并釋放膽汁以幫助消化食物。在幾納米到幾厘米的長度范圍內(nèi)模擬復(fù)雜結(jié)構(gòu)的能力對于最終的工程組織的功能實現(xiàn)至關(guān)重要。

為了實現(xiàn)功能性組織的制備，幾種創(chuàng)新的生物打印策略被開發(fā)出來。美國卡內(nèi)基梅隆大學(xué)Feinberg教授團(tuán)隊提出了一種利用懸浮水凝膠自由可逆嵌入（FRESH）來對膠原蛋白進(jìn)行3D生物打印的方法，能夠在不同的尺度上直接獲得具有精確控制組成和微觀結(jié)構(gòu)的人心臟組織成分，從毛細(xì)血管到整個器官，相關(guān)論文發(fā)表在《Science》上（EFL也分享解讀了這項開創(chuàng)性的工作，詳見文末“鏈接1”）。盡管FRESH打印取得的成果令人振奮，但這個過程仍然很慢，需要幾個小時才能制作出厘米級的組織。這樣使細(xì)胞暴露于次優(yōu)的培養(yǎng)環(huán)境中，導(dǎo)致細(xì)胞受到很大的應(yīng)力，進(jìn)而可能損害其功能。此外，緩慢的打印過程限制了這項技術(shù)的臨床轉(zhuǎn)化。

生物打印技術(shù)需要快速沉積各種類型的細(xì)胞和材料，以重建復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。Mohsen Akbari教授團(tuán)隊采用多材料生物打印，同時或順序分配不同的材料和細(xì)胞以實現(xiàn)組織仿生。然而，緩慢的沉積速度和在打印頭之間切換所需的時間會顯著降低生物打印速度，同時將細(xì)胞長時間保持在非生理環(huán)境中將影響打印后的細(xì)胞功能。Ali Khademhosseini教授團(tuán)隊使用一束毛細(xì)管構(gòu)成的打印頭，通過數(shù)字控制含有不同生物墨水的打印頭之間的快速平滑切換和協(xié)同工作，制備了復(fù)雜的組織結(jié)構(gòu)，提升了多材料生物打印的速度。長期以來，使用基于光的技術(shù)，例如數(shù)字光處理 (DLP)，進(jìn)行多材料生物打印一直是一項重大的技術(shù)挑戰(zhàn)。在打印過程中更換生物墨水既費(fèi)時又費(fèi)力，并且會損壞結(jié)構(gòu)和細(xì)胞。為了解決這個問題，Ali Khademhosseini教授團(tuán)隊開發(fā)出一種多材料DLP生物打印機(jī)，利用計算機(jī)控制的微流體生物墨水注射裝置將不同的生物墨水快速流動到圖案光的路徑上，同時實現(xiàn)自動化生物墨水更換和清洗步驟，將打印速度提高了5倍。

2. 增強(qiáng)細(xì)胞活力
在具有臨床尺寸（厘米級）的組織中保持細(xì)胞活力和功能面臨著許多挑戰(zhàn)，包括大量的處理時間、施加于細(xì)胞的高剪切應(yīng)力以及需要血管輸送氧氣與營養(yǎng)同時去除細(xì)胞廢物。

加利福尼亞大學(xué)伯克利分校Hayden K. Taylor團(tuán)隊開發(fā)出高速“容積3D打印技術(shù)”，只要光照幾十秒，完美雕像浮出水面。相關(guān)論文發(fā)表在《Science》上（EFL也分享解讀了這項開創(chuàng)性的工作，詳見文末“鏈接1”）。受計算機(jī)斷層掃描原理的啟發(fā)，烏得勒支大學(xué)Riccardo Levato教授團(tuán)隊使用體積打印在20秒內(nèi)將載有類器官的明膠水凝膠塑造成復(fù)雜的厘米級 3D 結(jié)構(gòu)（EFL也分享解讀了這項開創(chuàng)性的工作，詳見文末“鏈接2”）。到目前為止，體積生物打印技術(shù)還處于起步階段，這種方法需要大量的生物墨水和大量的細(xì)胞來打印大型組織。此外，當(dāng)前的體積打印機(jī)僅限于打印一種生物墨水，這限制了其在模擬天然組織的多組分復(fù)雜性方面的應(yīng)用。

打印方法和條件對細(xì)胞活力有很大影響。例如，基于擠壓的打印細(xì)胞在通過窄管時會受到很高的剪切應(yīng)力。細(xì)胞受到的剪切應(yīng)力與生物墨水粘度和打印速度成正比，與噴嘴直徑成反比。因此，任何提高打印速度和分辨率的努力都可能使細(xì)胞受到高剪切應(yīng)力并降低細(xì)胞活力。反之，降低生物墨水粘度可以提高細(xì)胞活力，但會阻礙可打印性并導(dǎo)致支架機(jī)械性能不佳。為了解決此問題，Mohsen Akbari教授團(tuán)隊使用同軸打印的方法，使細(xì)胞遠(yuǎn)離剪切應(yīng)力最高的通道壁，從而保護(hù)細(xì)胞免受粘性生物墨水帶來的流變剪切力。另一種策略是使用光學(xué)生物打印。因為這種方法不使用噴嘴進(jìn)行打印，所以細(xì)胞不會受到破壞性的剪切力。

生物墨水的物理和化學(xué)特性對打印后細(xì)胞的活力和功能也至關(guān)重要�，F(xiàn)有生物墨水的一個普遍缺點是孔徑小，這會阻礙可溶性分子的對流轉(zhuǎn)運(yùn)并阻礙細(xì)胞遷移和組織重塑。Griffin 等人使用顆粒材料制備支架用于皮膚組織快速再生，該生物墨水具有大表面體積比和短擴(kuò)散路徑的優(yōu)點，增強(qiáng)了向細(xì)胞的營養(yǎng)輸送以及廢物的去除，促進(jìn)了細(xì)胞的長期存活。此外，這些生物墨水的互連孔隙在支架降解之前促進(jìn)細(xì)胞向內(nèi)生長和組織重塑。Fang 等人使用具有不同尺寸和特性的微凝膠，制造出與天然組織結(jié)構(gòu)相似的極其復(fù)雜的組織結(jié)構(gòu)。事實上，顆粒狀生物墨水的廣泛應(yīng)用需要它們能夠模擬天然組織的各向異性和分層結(jié)構(gòu)。為此，具有非球形幾何形狀的微凝膠和 Janus 微�？捎糜谥圃祛w粒狀生物墨水。這可以與計算流體動力學(xué)和人工智能相結(jié)合，以最大限度地提高質(zhì)量傳遞和細(xì)胞向內(nèi)生長，同時保持生物打印組織的機(jī)械性能。

構(gòu)建功能性組織的障礙之一是確保工程結(jié)構(gòu)在制造后的長期生存。大自然通過形成一個多尺度的血管網(wǎng)絡(luò)完美地規(guī)避了這一挑戰(zhàn)，這些血管網(wǎng)絡(luò)在整個組織中相互交織。美國萊斯大學(xué)Jordan S. Miller與華盛頓大學(xué)Kelly R. Stevens合作，利用投影立體光刻（projection stereolithography）3D打印技術(shù)，制備出會“呼吸”的人工肺，只需數(shù)分鐘就可在透明光聚合水凝膠中制備具有3D內(nèi)部功能結(jié)構(gòu)的血管系統(tǒng)，相關(guān)論文發(fā)表在《Science》上，并被選為當(dāng)期封面。（EFL也分享解讀了這項開創(chuàng)性的工作，詳見文末“鏈接1”）。盡管基于光的方法相對較慢，但可以一次生成多個組織——這一特征對于藥物篩選的高通量組織生產(chǎn)至關(guān)重要。

3. 展望
在過去的幾年里，生物打印在各個方面都取得了長足的進(jìn)步。進(jìn)一步提高生物打印分辨率，同時允許制造具有厘米級尺寸的臨床相關(guān)組織，是下一個重要的里程碑。然而，實現(xiàn)高分辨率需要較長的打印時間，并且會在打印過程中將細(xì)胞暴露在高剪切應(yīng)力下，所有這些都可能會損壞細(xì)胞并損害打印后的細(xì)胞功能。因此，未來的努力應(yīng)該集中在使生物打印組織在生理環(huán)境中保持高細(xì)胞活力的創(chuàng)新上。此外，使用數(shù)值模擬工具和機(jī)器學(xué)習(xí)方法對生物打印參數(shù)和生物墨水的生物物理和生化特性進(jìn)行系統(tǒng)評估可以提高分辨率和組織模擬，同時保持細(xì)胞活力并最大限度地降低操作成本。

用于器官移植和再生醫(yī)學(xué)的具有臨床相關(guān)尺寸的生物打印組織需要數(shù)十億到數(shù)萬億個細(xì)胞，由此帶來了大批量細(xì)胞培養(yǎng)的挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)的平面培養(yǎng)系統(tǒng)無法大規(guī)模生產(chǎn)細(xì)胞。填充床培養(yǎng)系統(tǒng)和懸浮平臺可用于滿足生物打印大型組織的批量要求。然而，與擴(kuò)增和分化培養(yǎng)基的高成本、污染以及用于大規(guī)模生產(chǎn)細(xì)胞的現(xiàn)有分化方案的優(yōu)化相關(guān)的挑戰(zhàn)仍然存在。因此，生物反應(yīng)器設(shè)計的進(jìn)步和新型微載體的開發(fā)能夠?qū)崿F(xiàn)高產(chǎn)量的高密度細(xì)胞培養(yǎng)，這將極大地有利于組織打印領(lǐng)域。

用于器官移植的生物打印組織需要經(jīng)過嚴(yán)格的監(jiān)管程序，以確保其長期安全性和有效性。由于生物打印應(yīng)用的多樣性，受到 FDA不同部門的監(jiān)管，因此為建立生物打印產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定通用指南可能具有挑戰(zhàn)性。與器官移植相比，用于疾病建模的生物打印面臨的監(jiān)管障礙更少。然而，生物打印疾病模型仍需要驗證，以確保正確模擬結(jié)果臨床轉(zhuǎn)化所需的病理生理學(xué)和藥代動力學(xué)特性（例如炎癥反應(yīng)、代謝、分子轉(zhuǎn)運(yùn)）、穩(wěn)健性和可重復(fù)性。

總體而言，生物打印技術(shù)的不斷更迭和廣泛應(yīng)用，將極大地影響個性化醫(yī)療的發(fā)展。生物打印的未來應(yīng)用也不局限于器官移植和疾病建模，還可以用于創(chuàng)建含有藻類或細(xì)菌的結(jié)構(gòu)以生產(chǎn)可再生能源或捕獲二氧化碳，或者通過生產(chǎn)“人造肉”徹底改變食品行業(yè)。

文章來源：https://www.sciencedirect.com/sc ... i/S0092867422007206