清華大學熊卓和張婷教授課題組: 功能性心肌腔室的工程化構建最新進展

來源：生物打印再生工程
作者：吳炳炎

在過去的幾十年里，心臟組織工程領域取得了進步。然而，大多數(shù)研究進展僅限于具有簡單拓撲結構的微尺度工程化心肌組織 (ECT)，如3D條帶和心肌補片。盡管微尺度ECT有利于藥物篩選應用，但它們在心臟修復和心臟疾病體外建模方面的應用十分有限。最近，研究人員進行了各種嘗試來構建工程化心肌腔室 (ECP)，例如腔室，以重現(xiàn)天然心臟的結構復雜性。從微尺度ECT到宏觀ECP的轉(zhuǎn)變將大大加速其應用；然而，研究人員面臨著拓撲結構重建、血管化和功能成熟等障礙。

近日，清華大學機械工程系的熊卓和張婷教授課題組（BRE團隊）在Biomaterials發(fā)表了一篇名為“Recent advances on bioengineering approaches for fabrication of functional engineered cardiac pumps: a review”的綜述文章，總結了生物工程方法制造功能性工程化心肌腔室的最新進展。文章回顧了制造ECP的生物工程方法，總結了目前在微尺度和中觀尺度上設計血管系統(tǒng)的方法，介紹了使心臟組織功能成熟的各種策略，并對未來提出了展望。

背景介紹
在全球范圍內(nèi)，心血管疾病是人類死亡的主要原因，其患病率也在隨著人口老齡化而增加。當向心臟供血的動脈被阻塞時，心肌梗死與缺血性損傷有關，瘢痕組織中的纖維狀膠原蛋白和成纖維細胞取代死亡的心肌細胞(CM)，永久性降低泵血能力，最終導致心力衰竭。成人心臟是人體再生率最少的器官之一，心肌細胞每年的周轉(zhuǎn)率約為0.3-1%。迄今為止，心臟移植仍然是治療晚期心力衰竭的金標準，而供體器官長期短缺和免疫排斥一直是巨大的挑戰(zhàn)。因此，需要尋找治療缺血性心臟病的替代策略。

干細胞療法是一種很有前景的治療方法。在過去15年中，許多臨床實踐取得了進展，但仍有一些問題需要解決，包括腫瘤發(fā)生風險、移植物免疫排斥和移植物細胞死亡等。此外，這種方法的長期治療效果存在爭議，因為目前的分娩途徑，包括冠狀動脈注射、靜脈注射和心肌注射，導致細胞保留率/移植率低(<1%)和存活率低。在過去十年中，研究人員開始認識到干細胞療法主要通過旁分泌機制來發(fā)揮作用。因此，使用非編碼RNA包括微RNA(miRNA)、長非編碼RNA(lncRNA)和外泌體等方法吸引了越來越多的興趣。此外，研究人員最近報道，使用特定的轉(zhuǎn)錄因子組合，能夠?qū)⑿募」Ｋ篮蟮鸟�傷組織直接重編程到心肌細胞中，并在體內(nèi)和體外都得到了驗證。然而，盡管存在可行性且前景誘人，但應該指出，這些概念仍處于起步階段，需要在臨床應用前對安全性和有效性進行系統(tǒng)驗證。

此外，心臟組織工程也是一種治療方法。心臟組織工程的重點是在體外創(chuàng)造有功能的心臟組織替代物來替代或恢復受損的心肌。除心臟修復外，工程化心肌組織還可用于藥物篩選和體外心臟功能和疾病建模。在過去的幾十年里，心臟組織工程領域有兩個截然不同的方向。一個方向是在微尺度上發(fā)展具有最小結構復雜性的功能性工程心肌組織(ECT)，如3D條帶和心肌補片。微尺度ECT的厚度通常小于500 μm，不需要引入血管系統(tǒng)來滿足其代謝需求。相對較小的體積有利于其存活和體外成熟，此外，微尺度ECT能夠產(chǎn)生力并對藥物做出可預測反應。由于ECT拓撲結構重建簡單，且具有高通量和標準化的特點，其可應用于藥物篩選。

另一個方向是在宏觀尺度上開發(fā)工程化心肌腔室(ECP)，包括工程人類心室和完整的心臟模型。目前，在嚙齒類動物實驗中有治療效果的心臟心肌補片需要擴大，以滿足人類移植物的要求。更重要的是，單純擴大心臟心肌補片可能不足以完全恢復受損心臟的功能。對于先天性心臟病，如左心室發(fā)育不良綜合征，工程心室可能是一個更好的移植選擇。而對于終末期心力衰竭，在未來可能需要一個工程全心來代替捐贈的心臟。與微尺度ECT相比，宏觀ECP可作為研究心功能和疾病的更理想模型。ECP可以評估壓力-容積指標，并具有人類心臟的功能，因此有望最終取代動物模型。

在過去的幾年里，許多研究人員對制造ECP進行了各種嘗試。2018年，Parker的團隊通過在橢圓形電紡絲支架上播種細胞，開發(fā)了一個類似心室的腔室。然而，由于固有的低細胞播種效率(通常小于107個細胞/cm3)，工程心室的壁厚被限制在100 μm左右，導致收縮強度小得多，僅相當于其原生心室的2%左右。3D生物打印技術，特別是新型的嵌入式擠出生物打印技術，已成為制造工程化心肌腔室更理想的方法。2019年，Dvir的團隊通過在懸浮介質(zhì)中打印載有細胞的脫細胞胞外基質(zhì)生物墨水，生成了一個全尺寸的心臟模型。但由于體外培養(yǎng)時間不夠長，該模型未能實現(xiàn)大尺度收縮功能。最近，基于懸浮水凝膠的自由形式可逆嵌入 (FRESH) 技術，F(xiàn)einberg團隊產(chǎn)生了接近生理細胞密度(約3×108個細胞/cm3)和同步搏動能力的開放心室，以及一個無細胞全尺寸人類心臟模型。同樣，Ogle的團隊在懸浮介質(zhì)中通過3D打印產(chǎn)生封閉的心室，其細胞密度接近于人誘導多能干細胞的原位增殖和分化所獲得的生理細胞密度(約3×108個細胞/cm3)。然而，由于缺乏血管，這些研究中工程腦室的壁厚限制在200μm左右。到目前為止，大尺度ECP的發(fā)展仍處于起步階段，ECP內(nèi)單個心肌細胞的成熟度仍然不足。

從微尺度ECT到宏觀ECP，以及最終完整的心臟移植物的實現(xiàn)與幾個關鍵挑戰(zhàn)有關，包括拓撲結構重建、血管化和功能成熟(圖1)。本文的目的是回顧這些領域的最新技術進展，并為功能性ECP的進一步實現(xiàn)提供思路。在文章中，首先介紹了重構天然心臟的復雜拓撲結構重建特征的生物工程方法，并強調(diào)接近生理的細胞密度的作用，這對其生理功能至關重要。對于厚心臟組織和ECP來說，多尺度血管的整合是維持細胞活力所必需的。因此，本文也討論了心臟組織的血管化策略及其在宏觀ECP中的潛在適用性。此外，本文回顧了目前工程化心肌組織的成熟機制，強調(diào)了它們促進單個心肌細胞成熟的能力以及它們在宏觀ECP中的適用性。最后，本文針對相關挑戰(zhàn)、趨勢機遇，提出了一系列重要觀點。

圖1 體外構建工程化心肌腔室(ECP)的主要挑戰(zhàn)

工程化心肌腔室(ECP)的制造
在過去的幾十年里，出現(xiàn)了多種制造技術來設計制造工程化心肌組織和工程化心肌腔室。這些技術通常分為兩類，即自上而下的策略和自下而上的策略。不同的制造技術重現(xiàn)天然心臟的結構復雜性和細胞密度的能力存在差異(圖2)。自上而下的策略包括支架接種和水凝膠澆鑄的方法。盡管支架接種方法具有構建復雜結構的能力，但細胞接種密度較低(通常小于107/cm3)。水凝膠注模策略能夠?qū)崿F(xiàn)高細胞密度，但只能形成較為簡單的拓撲結構重建�；�于載細胞微單元模塊化組裝的自下而上策略包括自組裝、遠程組裝和定向組裝方法。其中，3D生物打印通過逐層精確定位細胞和生物材料，已成為最有前景的工程化心肌腔室構建方法。展望未來，工程化全心臟的最終實現(xiàn)方案可能在于細胞自組裝和3D生物打印技術的融合。

圖2 體外構建心肌組織的生物工程策略。自上而下的策略包括支架接種(a)和水凝膠注模(c)；自下而上策略包括自組裝、遠程組裝和定向組裝(b)。

圖3 工程化心肌腔室(ECP)制造方法。通過在旋轉(zhuǎn)橢圓形收集器上拉紡纖維制成納米纖維心室形支架，接種多能干細胞分化的心肌細胞并用導管傳感器縫合在管道上，在施加外部壓力的生物反應器中培養(yǎng)(a)；在灌注生物反應器中將完整大鼠心臟再細胞化(b)；在定制的模具中鑄造類器官并依次從模具中取出，構建的人類心室樣心腔(c)；通過噴墨打印構建半心臟模型(d)；在支撐槽內(nèi)打印帶有三腳架血管和分離的左右心室的心臟模型(e)；通過FRESH技術打印的接近生理細胞密度的開放心室(f)。

工程化心肌腔室(ECP)的血管化
天然心臟是高度血管化的器官。分級血管系統(tǒng)向單個心肌細胞輸送必需的營養(yǎng)和氧氣，并通過旁分泌信號促進心肌成熟和整體收縮功能。對于厚心臟組織的再生，促進營養(yǎng)交換的體外動態(tài)培養(yǎng)只能在有限的擴散距離下維持細胞活力，而宿主血管系統(tǒng)生長進入工程組織的血管生成過程通常需要數(shù)天到數(shù)周時間，無法提供及時的營養(yǎng)供應。因此，在移植時加入血管網(wǎng)絡，并促進其與宿主血管系統(tǒng)的整合對于確保厚心臟組織的細胞活力和功能成熟至關重要，ECP也是如此。

人類心臟中的分層血管系統(tǒng)包括動脈、小動脈、靜脈、小靜脈和毛細血管，直徑跨越幾個數(shù)量級。除內(nèi)皮內(nèi)層和基底膜外層外，微尺度毛細血管還稀疏地被周皮細胞覆蓋，而中尺度小動脈和大尺度動脈則被平滑肌細胞以及彈性蛋白和膠原纖維結合。毛細血管在大約200 μm的距離內(nèi)為實質(zhì)細胞提供有效的營養(yǎng)和氧氣交換，而肌肉動脈和小動脈控制著血液的搏動流動(圖4a)。到目前為止，研究人員在工程組織中微血管和中尺度血管的形成方面分別取得了很大進展(圖4b-f)。內(nèi)皮細胞可在載細胞基質(zhì)中自組裝形成微尺度毛細血管，然而它們往往難以在體外灌注并在體內(nèi)與宿主血管相吻合。生物工程方法可生成數(shù)百微米至數(shù)毫米的中尺度血管，并與宿主血管結合，然而它們不能有效地將營養(yǎng)物質(zhì)輸送到周圍組織。因此，大尺度ECP的長期生存需要在體外形成微、中尺度血管，模擬復雜的多尺度血管。

圖4 克服擴散限制的血管化策略。微尺度毛細血管(b-d)和中尺度血管(e-f)的體外形成是厚心臟組織所必需的；微尺度毛細血管的體外形成依賴于內(nèi)皮細胞(EC)的自組裝，其由血管新生和血管形成驅(qū)動(b)；微血管取向由拓撲結構重建或力學信號調(diào)節(jié)(c)；通過吸引周皮細胞和提供合適的力學環(huán)境促進微血管成熟(d)；單層血管的形成是通過在血管細胞存在時產(chǎn)生預先標記的通道或在EC播種后形成的(e)；通過同軸打印和擴散誘導凝膠化方法形成多層異質(zhì)血管(圖f)。

圖5 工程化心肌組織中微尺度、中尺度血管構建方法。內(nèi)皮細胞(EC)能夠自組裝成微毛細血管結構，由內(nèi)皮細胞特異性PECAM-A(綠色)和DAPI(藍色)染色(a)；EC在VEGF梯度(紅色箭頭)下萌發(fā)成膠原支架，并用羅丹明-鬼筆環(huán)肽(黃色)和DAPI(藍色)染色。白色和無色箭頭分別表示與莖細胞相連和分離的尖端細胞(b)；機械約束條件下纖維蛋白凝膠中微毛細管取向，內(nèi)皮細胞由紅色 hCD31標記，轉(zhuǎn)導周皮細胞由綠色熒光蛋白(GFP)標記，細胞核由藍色Hoescht標記(c)；與GelMA水凝膠中的血管周圍細胞共培養(yǎng)促進微毛細血管的成熟和穩(wěn)定。其中內(nèi)皮細胞由DsRed標記，表達αSMA的平滑肌細胞從間充質(zhì)干細胞分化而來(d)；通過逐層組裝具有預先設計拓撲結構重建形狀的膠原水凝膠，形成可灌注血管通道。內(nèi)皮細胞用CD31(紅色)和DAPI(藍色)染色(e)；在3D打印的易流變性Pluronic F127模板上澆鑄載細胞水凝膠形成可灌注血管通道，通道內(nèi)有HUVEC(紅色)襯里，周圍組織包裹有人類新生兒真皮成纖維細胞(HNDFs，綠色)(f)；使用載有EC的犧牲生物墨水3D打印微纖維，通過犧牲打印的方法制造血管化心臟心肌補片，用CD31(綠色)和肌動蛋白(粉紅色)染色(g)；通過犧牲打印策略形成血管通道，并用HUVECs(綠色)灌注(h)；用DMD立體光刻法直接制造血管化組織，HUVEC(紅色)封裝在通道中，HepG2細胞(綠色)封裝在周圍組織中(i)；利用光切除的方法在熒光素修飾的水凝膠(綠色)中生成仿生血管通道，并用熒光微珠(紅色)灌注(j)；通過同軸打印策略形成雙層血管(圖k)。

工程化心肌腔室(ECP)的成熟
一方面，雖然微智造技術特別是3D打印技術能夠精確控制細胞和生物材料的空間沉積，以創(chuàng)建腔室的拓撲結構重建形狀，但工程化心肌腔室不能自動獲得天然心臟的功能。工程組織通常需要經(jīng)過數(shù)周或數(shù)月的體外培養(yǎng)，通過細胞黏附、組織和基質(zhì)沉積等方式完成組織形態(tài)形成和成熟。另一方面，多能干細胞的出現(xiàn)，包括胚胎干細胞(ESC)和誘導多能干細胞(iPSC)，為體外產(chǎn)生心肌細胞(CM)提供了有效的細胞來源，并且具有臨床規(guī)模的高通量和高純度。然而，干細胞分化的心肌細胞(PSC-CM)通常是不成熟的，其結構和功能特征類似于胎兒心肌細胞(約第十六周)，細胞和組織水平上的不成熟性已經(jīng)極大地阻礙了其在心肌再生中的應用。例如，PSC-CM衍生的心臟心肌補片由于其獨立的、異質(zhì)性的收縮活動可能改變宿主心肌的電傳播，從而導致致命的心律失常風險。迄今為止，通過模擬心臟發(fā)育過程中的體內(nèi)環(huán)境，已經(jīng)開發(fā)出多種策略來促進心臟工程組織的功能成熟(圖6)。本文回顧了目前工程化心肌組織的成熟策略，并強調(diào)了它們在工程化心肌腔室成熟中的潛在作用。雖然目前大多數(shù)成熟策略都是通過二維培養(yǎng)模型、微尺度的類器官或心臟構建物來證明的，但這些成熟策略與血管化策略相結合，有潛力在更大尺度上應用于工程化心肌腔室的成熟。

圖6 模擬體內(nèi)環(huán)境的體外成熟策略。在胎兒早期，胚胎心臟長成新月體，之后形成由心肌層和心內(nèi)膜層組成的心管，兩者之間有果凍狀的細胞外基質(zhì)。在胎兒晚期，心管通過折疊和旋轉(zhuǎn)成環(huán)，并在冠狀血管系統(tǒng)和傳導系統(tǒng)開始發(fā)育的同時轉(zhuǎn)變?yōu)榍皇倚呐K。代謝改變、細胞外基質(zhì)和非肌細胞相互作用以及機械和電刺激協(xié)同作用，促進CM從未成熟胎兒期向完全成熟成人期發(fā)育(a)；hiPSC心源性分化能夠得到成熟程度與早期胎兒CM相當hiPSC-CM。目前已建立了一套促進心臟工程組織體外成熟的生物工程方法，包括長期培養(yǎng)、生化誘導、與非肌細胞共培養(yǎng)、細胞-基質(zhì)相互作用和生物物理刺激等(b)。

展望與總結
在過去的幾年里，具有復雜拓撲結構重建特性的宏觀ECP的制備策略和微尺度ECT的成熟策略取得了顯著的進展。隨著干細胞、生物材料和3D生物打印等技術的快速發(fā)展和融合交叉，功能性工程化心肌腔室的體外制造取得了長足的進步，人類有望迎來完整的人工心臟。本篇綜述討論了功能性工程化心肌腔室的一些主要挑戰(zhàn)和重要瓶頸，如與制造、血管化和成熟相關的問題。解決這些挑戰(zhàn)可以在很大程度上推進心臟修復和心臟疾病的體外建模的技術水平。除了這些瓶頸，其他關鍵的挑戰(zhàn)包括PSC-CM的成本效益和宏觀擴展、工程心肌與宿主心肌的電整合、宿主機體的免疫排斥、低溫保存和監(jiān)管障礙等，需要在未來的臨床轉(zhuǎn)化中加以解決。


參考文獻
本文第一作者為清華大學機械系生物制造中心的博士后方永聰，通訊作者為清華大學機械系生物制造中心的熊卓副教授、張婷副研究員。

Fang Y, Sun W, Zhang T, Xiong Z. Recent advances on bioengineering approaches for fabrication of functional engineered cardiac pumps: A review. Biomaterials 2022;280:121298.
https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2021.121298