3D打印具有生物催化功能的活體材料

來(lái)源：智能材料與再生醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室

生命的組成部分主要來(lái)源于能夠形成或組裝具有高級(jí)結(jié)構(gòu)和復(fù)雜特征的生命系統(tǒng)的生物體。作為這類生物體的一個(gè)組成部分，細(xì)胞可以被招募來(lái)構(gòu)建用于能量收集、傳感、修復(fù)和驅(qū)動(dòng)的合成生物材料或結(jié)構(gòu)。在這方面，細(xì)胞要么構(gòu)建材料本身，要么以特定方式調(diào)節(jié)材料的功能性能。例如，轉(zhuǎn)基因微生物已被用于產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)材料；這些材料已被用于多種應(yīng)用，如生成自組裝層次結(jié)構(gòu)、發(fā)現(xiàn)新型功能聚合物以及維持此類結(jié)構(gòu)以響應(yīng)環(huán)境刺激。此外，微生物可以在生物混雜材料工程中與脫細(xì)胞成分協(xié)同工作，從而產(chǎn)生從生物制造和生物修復(fù)到生物醫(yī)學(xué)工程的潛在應(yīng)用。尤其是生物催化活性材料，由于其在廣泛領(lǐng)域的適用性，最近引起了科學(xué)家們?cè)絹?lái)越多的興趣。作為生物催化劑的微生物可以通過(guò)自然或精心設(shè)計(jì)的細(xì)胞內(nèi)化學(xué)級(jí)聯(lián)反應(yīng)將底物轉(zhuǎn)化為有價(jià)值的化學(xué)品，因此它們經(jīng)常用于發(fā)酵和污染物去除等領(lǐng)域。盡管前景看好，但將功能微生物與生物加工相結(jié)合的想法尚未得到充分探索。一個(gè)挑戰(zhàn)是，整個(gè)過(guò)程需要在材料可制造性與細(xì)胞活力和功能性之間取得平衡。此外，由于生物加工過(guò)程的動(dòng)態(tài)控制仍然是該領(lǐng)域最大的挑戰(zhàn)之一，因此迫切需要能夠創(chuàng)建具有明確3D形狀的定制活體材料的策略，特別是在以空間方式進(jìn)行分布的同時(shí)改變其組成和功能特性。

有鑒于此，南京工業(yè)大學(xué)材料化學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的余子夷、陳蘇教授團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一種具有生物催化功能的活體材料，其由雙網(wǎng)絡(luò)高分子和微生物細(xì)胞共同構(gòu)成，并且其可用作生物墨水，通過(guò)生物3D打印設(shè)備進(jìn)行精準(zhǔn)制造。

相關(guān)研究工作以 “3D Printed Biocatalytic Living Materials with Dual-Network Reinforced Bioinks” 為題發(fā)表在《SMALL》期刊上，該研究得到了國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃 “合成生物學(xué)”重點(diǎn)專項(xiàng)、國(guó)家自然科學(xué)基金、江蘇省自然科學(xué)基金等項(xiàng)目的資助。

NO.1

為了生成可印刷油墨，首先，在室溫下，在 PBS 緩沖鹽水中，將全功能化的 HA 聚合物與 CB[8] 預(yù)復(fù)合。HA 中帶 N 端電荷的苯丙氨酸能夠與 CB[8] 以 2:1 的比例形成同質(zhì)復(fù)合物，從而產(chǎn)生具有物理交聯(lián) 3D 網(wǎng)絡(luò)和宏觀可逆觸變性的超分子凝膠（圖 1a）。然后通過(guò)將超分子凝膠與微生物混合來(lái)獲得生物墨水。

其次，使用載有微生物的 CB超分子水凝膠來(lái)數(shù)字打印有利于長(zhǎng)期細(xì)胞功能的活體 3D 支架。Bioinks 被加載到配備三軸機(jī)械機(jī)械臂的壓力控制分散盒中（圖 1b）。為了確定打印分辨率，作者分別打印了具有 1500、840、580、410 和 250 μm 不同噴嘴直徑的 2D 蛇形圖案（圖S6，支持信息）。打印的細(xì)絲在整個(gè)圖案上具有均勻的厚度，在 250 μm 處顯示出良好的打印分辨率。CB[8] 介導(dǎo)的超分子水凝膠適用于 3D 打印，因?yàn)樗�在通過(guò)打印針擠出時(shí)具有剪切稀化行為（圖 1c））。打印完成后，在紫外線輻射下啟動(dòng)二次共價(jià)交聯(lián)，以提高結(jié)構(gòu)的機(jī)械性能，這有利于水凝膠的進(jìn)一步處理和長(zhǎng)期細(xì)胞培養(yǎng)（圖 1d）。

圖1 基于功能化的透明質(zhì)酸的雙交聯(lián)載體的設(shè)計(jì)

圖S6  噴嘴直徑分別為250微米、410微米、580微米、840微米和1500微米的二維蛇形圖案（從左到右）比例尺為3毫米

NO.2

圖 2c表明 CB-HA 和 CB-HA-細(xì)胞的臨界應(yīng)變約為 200%，而 HA-細(xì)胞的損耗模量幾乎等于其儲(chǔ)能模量，進(jìn)一步表明添加 CB 交聯(lián)劑后機(jī)械性能的提高。紫外線照射后，材料的儲(chǔ)能模量增加了10倍，在8000Pa左右。值得注意的是，材料中酵母細(xì)胞的存在并未顯著改變其流變行為，因?yàn)榫�性粘彈性區(qū)域中含有細(xì)胞的樣品的動(dòng)態(tài)模量與不含細(xì)胞的樣品的動(dòng)態(tài)模量接近。此外，應(yīng)變恢復(fù)是基于軟物質(zhì)的 3D 打印應(yīng)用的關(guān)鍵特征，因?yàn)樗�可以快速恢�?fù)機(jī)械性能，從而確保打印后的結(jié)構(gòu)保真度。 圖2d表示了水凝膠的循環(huán)流變測(cè)試。在較低的應(yīng)變下，水凝膠儲(chǔ)能模量超過(guò)損耗模量，并在應(yīng)變急劇變化后立即以相反的方式表現(xiàn)。剪切稀化是設(shè)計(jì) 3D 可打印墨水的另一個(gè)不可或缺的因素，因?yàn)樗�允許通過(guò)打印針輕松擠出，其中由于收縮而顯著增加了剪切應(yīng)力。所有三個(gè)樣品在更高的剪切速率下都顯示出剪切稀化行為（圖 2e），顯示出它們?cè)诨�于擠出的 3D 打印應(yīng)用中的應(yīng)用前景。除了流變學(xué)特征外，細(xì)絲塌陷（圖S7a，支持信息）和細(xì)絲融合（圖S7b），支持信息）進(jìn)行了測(cè)試以表征生物墨水的機(jī)械性能。作者還通過(guò)掃描電子顯微鏡 (SEM) 檢查了生物墨水的表面形態(tài)。然后，作者探索了 CB生物墨水對(duì)基于擠出的 3D 打印平臺(tái)的適用性。生物墨水由氣泵擠出和控制，并使用機(jī)械臂來(lái)操縱噴嘴的運(yùn)動(dòng)以確保墨水的準(zhǔn)確沉積（圖 2f）作為演示，制造了具有高結(jié)構(gòu)的3D晶格立方體保真度。打印后，將 3D 結(jié)構(gòu)在 Irgacure 2959 存在的情況下暴露于紫外線下 3 分鐘，以增強(qiáng)其機(jī)械剛度。為了證明 bioinks 的生物相容性，嵌入的酵母細(xì)胞用活/死熒光染料染色。如圖 2h和圖S9所示, 支持信息，在紫外線照射后，大多數(shù)酵母細(xì)胞存活，細(xì)胞活力高達(dá) 85%，這表明材料和交聯(lián)程序沒(méi)有顯著影響細(xì)胞活力。SEM 圖像顯示 3D 晶格具有亞毫米孔（圖 2i-k），具有逐層堆疊結(jié)構(gòu)（圖 2j）。此外，載有細(xì)胞的 3D 晶格的 SEM 圖像顯示酵母細(xì)胞（通過(guò)成像處理呈黃色）位于 HA 基質(zhì)上（圖 2k）。

圖2 活體材料的3D打印

圖S7（a） 水凝膠絲斷裂試驗(yàn)的示意圖

圖S9 懸浮酵母細(xì)胞的熒光顯微圖像。比例尺代表50μm

NO.3

利用酵母對(duì)葡萄糖的厭氧發(fā)酵來(lái)證明該平臺(tái)的適用性。作者設(shè)計(jì)了一種酵母提取物蛋白胨葡萄糖 (YPD) 培養(yǎng)基回收裝置（圖 3a），旨在最大限度地提高發(fā)酵過(guò)程中的生產(chǎn)力。載有細(xì)胞的 3D 晶格與與對(duì)照組相同成分的大塊水凝膠一起制造（圖 3b）。作者首先測(cè)試了材料的細(xì)胞相容性，其中酵母細(xì)胞被嵌入大塊雙交聯(lián)水凝膠中并孵育 16 小時(shí)。結(jié)果如圖S11, 支持信息，可以注意到細(xì)胞增殖，因?yàn)榉跤?16 小時(shí)后細(xì)胞密度增加。為了測(cè)量這兩個(gè)生物反應(yīng)器的代謝活性，作者評(píng)估了它們?cè)?15 小時(shí)內(nèi)的整體乙醇產(chǎn)量，這表明 3D 晶格產(chǎn)生的乙醇明顯高于其本體對(duì)應(yīng)物。作者進(jìn)一步評(píng)估了乙醇生產(chǎn)力的進(jìn)展和發(fā)酵過(guò)程中這兩種結(jié)構(gòu)的產(chǎn)量。圖 3c,d總結(jié)了 3D 晶格和塊狀水凝膠的乙醇生產(chǎn)率和產(chǎn)量，按各自的權(quán)重歸一化。兩種結(jié)構(gòu)都能夠從一開(kāi)始就產(chǎn)生乙醇，而在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，晶格的乙醇產(chǎn)率高于散裝水凝膠。作者將這種差異歸因于晶格的比表面積增加，這促進(jìn)了反應(yīng)物和產(chǎn)物與環(huán)境的交換。整體發(fā)酵動(dòng)力學(xué)顯示出一條 S 形曲線，晶格和散裝水凝膠的乙醇生產(chǎn)率在大約 3 小時(shí)達(dá)到峰值，然后緩慢下降，直到此后達(dá)到平臺(tái)期。發(fā)酵15 小時(shí)，充滿細(xì)胞的晶格內(nèi)產(chǎn)生了 17.9 g·L-1 的乙醇，大約是其塊狀對(duì)應(yīng)物的兩倍。

圖3 生物催化活體材料的發(fā)酵性能

圖S11  在發(fā)酵和冷凍干燥一個(gè)月后，活酵母細(xì)胞在不同深度嵌入3D支架中的共焦顯微圖像。比例尺代表50μm

NO.4

為了進(jìn)一步證明作者方法的多功能性，作者創(chuàng)建了一個(gè)用于生物修復(fù)的細(xì)菌-微藻共培養(yǎng)生物材料系統(tǒng)。生物修復(fù)已成為比傳統(tǒng)方法更具優(yōu)勢(shì)的替代方法，例如物化吸附、化學(xué)氧化等昂貴且容易造成二次污染的方法。相比之下，生物解毒更環(huán)保，因?yàn)樗�通過(guò)生物轉(zhuǎn)化將有害的有機(jī)化學(xué)物質(zhì)代謝成無(wú)害的 CO2。在此，作者研究了用于去除丙烯酰胺和甲基橙的芽孢桿菌-小球藻共培養(yǎng)系統(tǒng)�？莶菅挎邨U菌能夠利用有機(jī)化學(xué)品作為碳源并將其轉(zhuǎn)化為 CO2，CO2依次被普通小球藻捕獲并通過(guò)光合作用轉(zhuǎn)化為氧氣（圖 4a）。反之，小球藻產(chǎn)生的氧氣被枯草芽孢桿菌捕獲進(jìn)行有氧呼吸，形成良性生態(tài)循環(huán)。然后作者將該共培養(yǎng)系統(tǒng)固定到 CB[8] 介導(dǎo)的雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠中，并通過(guò)增材制造構(gòu)建 3D 晶格。細(xì)菌-微藻共培養(yǎng)系統(tǒng)的3D模型如圖4b所示 . 在共聚焦顯微鏡下，在發(fā)出強(qiáng)烈紅色熒光的葉綠素（圖4c）的存在下，印刷的晶格看起來(lái)是綠色的 ，這表明存在大量活的小球藻細(xì)胞。載有細(xì)胞的晶格的 SEM 圖像顯示出與含有酵母細(xì)胞的晶格相似的表面形態(tài)（圖 4d），這表明加載兩種類型的微生物不會(huì)破壞晶格的多孔結(jié)構(gòu)。打印和固化后，將裝有細(xì)菌和藻類的格子支架置于合成介質(zhì)中。如圖4e所示 ，支架膨脹了大約 1.5 倍的重量（圖S12，支持信息）。嵌入式共培養(yǎng)系統(tǒng)經(jīng)過(guò) 12 小時(shí)光照和 12 小時(shí)黑暗循環(huán)以實(shí)現(xiàn)高性能。檢查了細(xì)菌-微藻系統(tǒng)降解有機(jī)物質(zhì)的能力（圖 4f）。降解動(dòng)力學(xué)表明，在前 12 小時(shí)內(nèi)，大約 70% 的甲基橙被去除，而芳酰胺則被去除了 40%。48小時(shí)后，90%以上的有機(jī)物被降解。

圖4 多細(xì)胞生物活體材料用于二氧化碳固定和生物修復(fù)

圖S12  負(fù)載微生物的3D結(jié)構(gòu)的溶脹率（a）負(fù)載酵母細(xì)胞，（b）負(fù)載細(xì)菌微藻

綜上，該工作利用動(dòng)態(tài)化學(xué)以及雙交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)的方法，成功開(kāi)發(fā)了一種新的可打印的生物墨水，制造了在微尺度空間固定微生物和構(gòu)建多細(xì)胞共生的生物活體材料，實(shí)現(xiàn)了生物催化的強(qiáng)化。利用3D打印技術(shù)，提高了整個(gè)材料的傳質(zhì)效果，和傳統(tǒng)的大塊材料相比，顯著提高了材料的生物催化效果。同時(shí)，該材料還具有可循環(huán)性，并且在低溫或者凍干的保存條件下依然保持了良好的催化活性。這項(xiàng)工作為探索新的生物相容性良好的可打印生物墨水提供了一個(gè)新的突破。

文章鏈接：https://doi.org/10.1002/smll.202104820