基于多材料打印的三維血管化肝臟組織模型

來源：EngineeringForLife  

血管幾乎遍及人體所有組織，對(duì)人體病理生理有重要影響。然而，目前對(duì)于多尺度血管的生物制造仍然面臨很多問題。來自中國科學(xué)院動(dòng)物所顧奇研究員聯(lián)合中國科學(xué)院沈陽自動(dòng)化研究所鄭雄飛研究員以及中國科學(xué)院化學(xué)研究所王樹研究院團(tuán)隊(duì)利用定制的打印機(jī)，開發(fā)了一種多材料打印制備血管化組織的方法，在藥物篩選以及肝組織工程中有著巨大的應(yīng)用前景。相關(guān)論文“3D Liver Tissue Model with Branched Vascular Networks by Multimaterial Bioprinting”發(fā)表于雜志Advanced Healthcare Materials上。

圖1 多材料生物打印策略的示意圖

為了將GelMA的最佳打印性能和纖維蛋白的血管生成性能結(jié)合起來，研究者使用了由GelMA和纖維蛋白混合物組成的載細(xì)胞墨水。SEM圖像顯示，隨著GelMA濃度的降低，連通孔隙的平均尺寸增大，并且纖維蛋白添加后，孔的平均尺寸減小。多孔結(jié)構(gòu)可促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)擴(kuò)散，提高細(xì)胞存活率。為了評(píng)估墨水的生物相容性，將含有不同熒光的細(xì)胞共同包被在GF基質(zhì)中，并使用共聚焦顯微鏡定量毛細(xì)血管樣網(wǎng)絡(luò)形成的程度。結(jié)果表明，水凝膠中形成了毛細(xì)管樣結(jié)構(gòu)。3% GelMA + 0.25% 纖維蛋白（3GF）中形成的毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)比3% GelMA（3G）或5% GelMA + 0.25% 纖維蛋白（5GF）中更豐富、更長。因此，在接下來的研究中，3GF被選擇作為載細(xì)胞墨水。（圖2）

圖2 GF水凝膠的表征和毛細(xì)血管狀網(wǎng)絡(luò)的形成

墨水的粘度是影響打印過程的重要因素之一。為此，研究者評(píng)估了在不同溫度條件下GelMA的粘度。并且對(duì)粘度數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，建立了表征粘度-溫度-濃度的三維熱圖。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3%GelMA在零度溫度以上，能實(shí)現(xiàn)粘度可控的最低濃度。使用電驅(qū)動(dòng)擠壓GelMA，并調(diào)節(jié)溫度控制系統(tǒng)以保持生物墨水處于凝膠狀態(tài)。為了設(shè)計(jì)和制造血管化組織結(jié)構(gòu)，研究者設(shè)計(jì)并打印了幾種不同的結(jié)構(gòu)體來演示具有通道結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定打印結(jié)構(gòu)體的形成。（圖3）

圖3 3D打印血管結(jié)構(gòu)

為了為長期培養(yǎng)提供穩(wěn)定的灌注，研究者制作了一個(gè)連續(xù)流灌注系統(tǒng)。將HUVEC和MSC作為單細(xì)胞，用3GF包被打印并進(jìn)行比較，研究了灌注培養(yǎng)過程中單個(gè)細(xì)胞和多個(gè)細(xì)胞聚集的活力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，打印的細(xì)胞可隨著時(shí)間的推移而增殖。接下來為了證明血管化組織的形成，研究者使用HUVEC和HFF共培養(yǎng)聚集物進(jìn)行打印，與3GF水凝膠培養(yǎng)3天后，進(jìn)行血管形成和管腔形成的形態(tài)學(xué)評(píng)估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)打印出來的組織顯示多個(gè)細(xì)胞聚集，并形成毛細(xì)血管樣網(wǎng)絡(luò)。將HUVEC植入構(gòu)建的通道中，經(jīng)過一夜的連續(xù)灌注培養(yǎng)后，細(xì)胞聚集，仍可維持較高的細(xì)胞密度。（圖4）

圖4 組織灌注培養(yǎng)和聚集打印在體外形成血管網(wǎng)

為了在體外構(gòu)建肝臟模型，研究者將HUVECs、MSCs和HepG2聚集物封裝在水凝膠中，觀察細(xì)胞的分布以及相關(guān)基因的表達(dá)。打印組織顯示HUVECs和MSCs形成毛細(xì)血管樣網(wǎng)絡(luò)，并出現(xiàn)多個(gè)細(xì)胞聚集。通過PCR測定相關(guān)基因的表達(dá)，來評(píng)估該肝單元的功能。最終選擇培養(yǎng)7天的肝組織進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。將打印的組織植入小鼠腹膜下，選擇3GF水凝膠作為對(duì)照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在移植后第7天肝組織出現(xiàn)新生血管。最后研究者通過大鼠動(dòng)脈血管移植，證明了這些組織可以直接用于手術(shù)吻合宿主血管。（圖5）

圖5 血管化肝組織的制造

綜上所述，本研究首次證明了可以使用低濃度的GelMA和纖維蛋白作為生物墨水，以擠壓為基礎(chǔ)打印血管化組織。這種基于3D打印的方法使我們能夠在厘米級(jí)組織中構(gòu)建具有活性組織功能的血管網(wǎng)絡(luò)。此外，它為藥物篩選、研究人體組織發(fā)育和疾病，以及明確肝組織工程移植治療開辟了一條可行的途徑。

參考文獻(xiàn)

Xin Liu,Xinhuan Wang， et al. 3D Liver Tissue Model with Branched Vascular Networks by Multimaterial Bioprinting. Advanced Healthcare Materials
https://doi.org/10.1002/adhm.202101405