AHM：用于3D打印的硫醇/降冰片烯功能化明膠水凝膠

來(lái)源：EngineeringForLife

光固化明膠基水凝膠由于其優(yōu)異的生物相容性、生物降解性、光響應(yīng)性、熱敏性和生物打印性能，已成為組織工程中常用的生物墨水。來(lái)自Karlsruhe Institute of Technology的Ute Schepers團(tuán)隊(duì)提出了一種降冰片烯功能化明膠(GelNB)的水基合成方法，其與巰基化明膠(GelS)混合，通過(guò)點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生超快光固化凝膠GelNB/GelS。這種水凝膠在未來(lái)的醫(yī)療應(yīng)用和生物制造技術(shù)中很有使用前景。相關(guān)論文“Tuning Superfast Curing Thiol-Norbornene-Functionalized Gelatin Hydrogels for 3D Bioprinting”發(fā)表于Advanced Healthcare Materials雜志上。

研究者開發(fā)了一種新的GelNB的合成方法（圖1A），首先，降冰片烯（NBCA）在pH為5-6的MES緩沖液中溶解，經(jīng)EDC·HCl和NHS活化轉(zhuǎn)化為琥珀酰亞胺酯。羧酸、EDC·HCl和NHS的摩爾比為1:2:1。加入明膠后，將pH提高到7.5~ 7.8，引起明膠伯胺與琥珀酰亞胺酯的反應(yīng)，從而制得GelNB。而GelS的制備反應(yīng)、凈化和儲(chǔ)存在惰性氣體氣氛下進(jìn)行，以防止二硫鍵的形成。然后采用TNBSA分析對(duì)DoF進(jìn)行量化(圖1B-C)，發(fā)現(xiàn)GelNB的DoF高達(dá)97%。GelS的DoF盡管與GelNB相比較低，但也在正常范圍內(nèi)。

圖1 GelNB和GelS前驅(qū)體合成原理圖

接下來(lái)研究者對(duì)三種不同交聯(lián)密度的GelNB/GelS水凝膠的性能進(jìn)行測(cè)試。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，水凝膠的溶脹能力隨著交聯(lián)程度的增加而降低，這是由于聚合物網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更緊密、更不靈活。同時(shí)，降解結(jié)果表明，低交聯(lián)度的GelNB/GelS降解速度更快，可在7天內(nèi)完全降解。這是因?yàn)榻宦?lián)密度決定了酶對(duì)水凝膠網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部結(jié)構(gòu)的擴(kuò)散能力，因此低交聯(lián)水凝膠的分解速度加快。并且光引發(fā)劑濃度的降低對(duì)GelNB/GelS水凝膠的固化時(shí)間影響不大。而GelNB/DTT水凝膠的固化時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，且隨著LAP用量的減少而增加。（圖2）

圖2 GelNB/GelS的性能

接著，研究者研究了未交聯(lián)的GelNB和GelS與GelMA的生物相容性，并評(píng)估了它們的前驅(qū)體的毒性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)GelNB和GelS前驅(qū)體在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)表現(xiàn)出類似的生物相容性，而GelMA的細(xì)胞活力僅在2h后就顯著下降。對(duì)于3D生物打印來(lái)說(shuō)，在數(shù)分鐘到數(shù)小時(shí)的合理時(shí)間內(nèi)，細(xì)胞在未交聯(lián)的前驅(qū)體溶液中保持高水平的活性是很重要的，因此，基于硫代烯的生物墨水是更有利的3D打印材料。(圖3)

圖3 GelNB/GelS的生物相容性

將正常人真皮成纖維細(xì)胞(NHDF)被包埋在GelNB/GelS水凝膠中培養(yǎng)14天，以研究細(xì)胞的粘附、擴(kuò)散、活力和增殖行為。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞在低交聯(lián)水凝膠中細(xì)胞擴(kuò)散和增殖速度要快得多。除了不同的交聯(lián)速率，研究者還研究了GelNB/GelS水凝膠中NHDF的生物學(xué)性能，并與GelNB/DTT和GelMA進(jìn)行比較(圖4C，D)。培養(yǎng)7天后，三種水凝膠中成纖維細(xì)胞均呈紡錘形，細(xì)胞活力無(wú)顯著差異。盡管這三種水凝膠對(duì)3D細(xì)胞培養(yǎng)都非常適合，但3D生物打印中，生物墨水的制備和光交聯(lián)通常會(huì)根據(jù)層的大小延遲幾分鐘。因此，必須考慮甲基丙烯酸酯基團(tuán)的副反應(yīng)以及交聯(lián)劑和光引發(fā)劑的毒性對(duì)于細(xì)胞的影響。

圖4 GelNB/GelS的細(xì)胞3D培養(yǎng)

通過(guò)對(duì)不同交聯(lián)度的GelNB/GelS水凝膠的流變行為進(jìn)行了測(cè)定發(fā)現(xiàn)，GelNB/GelS的G '隨著聚合物網(wǎng)絡(luò)中交聯(lián)密度的增加而增加。測(cè)量光交聯(lián)前三種前驅(qū)體溶液在14℃下的存儲(chǔ)模量，確定了氨基功能化對(duì)溫度誘導(dǎo)的可逆凝膠過(guò)程的影響(圖5B)。與交聯(lián)GelNB/GelS水凝膠趨勢(shì)相反。G'隨交聯(lián)密度的增加而降低。這是因?yàn)榻当�片烯基團(tuán)具有疏水特性和空間位阻，它通過(guò)阻止明膠鏈在低溫下自組裝成三螺旋來(lái)擾亂物理凝膠作用。此外，研究者還測(cè)定了未交聯(lián)GelNB/GelS溶液的剪切粘度分布，以評(píng)估其對(duì)基于擠壓的3D生物打印的適用性(圖5C)。在37℃時(shí)，GelNB/GelS前驅(qū)體溶液具有很強(qiáng)的類液性，表現(xiàn)出近似牛頓力學(xué)行為，粘度對(duì)剪切速率沒有明顯的依賴關(guān)系。

圖5 GelNB/GelS的流變學(xué)行為

最后，使用含NHDF的水凝膠前驅(qū)液進(jìn)行3D打印，以評(píng)價(jià)GelNB/ GelS與GelMA的生物墨水性能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，巰基生物墨水提高了細(xì)胞存活率，并且交聯(lián)度越高，細(xì)胞存活率越低，而且GelNB/GelS的細(xì)胞活性明顯優(yōu)于GelMA，并且細(xì)胞形態(tài)良好。

圖6 GelNB/GelS的3D打印

綜上所述，本研究開發(fā)了一種新型的水基合成路線，制備了用于3D生物打印的超快固化GelNB/GelS水凝膠。該水凝膠具有優(yōu)越的生物相容性，出色的3D生物打印性能，并且成本低，在組織工程和光基生物制造技術(shù)中有著巨大的使用前景。

參考文獻(xiàn)

Tobias Göckler, Sonja Haase, Xenia Kempter, Rebecca Pfister, Bruna R. Maciel, Alisa Grimm, Tamara Molitor, Norbert Willenbacher, Ute Schepers. Tuning Superfast Curing Thiol-Norbornene-Functionalized Gelatin Hydrogels for 3D Bioprinting. Advanced Healthcare Materials.
https://doi.org/10.1002/adhm.202100206