近場(chǎng)直寫打印水凝膠復(fù)合結(jié)構(gòu)：用于分層誘導(dǎo)功能性軟骨再生

盡管骨軟骨組織工程取得了重大進(jìn)展，但要成功地重建具有不同空間組成、結(jié)構(gòu)和功能特性的三維類似本源的復(fù)雜組織仍是一個(gè)挑戰(zhàn)。上海交通大學(xué)戴尅戎院士團(tuán)隊(duì)受細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)組成的梯度和原生骨軟骨組織中的膠原纖維結(jié)構(gòu)的啟發(fā)，設(shè)計(jì)并利用近場(chǎng)直寫技術(shù)制造了三層：淺表軟骨（S），深軟骨(D)，和軟骨下骨(B)的PCEC分層支架，并在其中填充含有間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)的甲基丙烯酰胺(GelMA)水凝膠與區(qū)域特異性生長(zhǎng)因子。復(fù)合支架在體內(nèi)同時(shí)實(shí)現(xiàn)軟骨和軟骨下骨再生，證明仿生構(gòu)建模擬自然骨軟骨組織的空間變化，并以增強(qiáng)骨軟骨組織再生的可行性，相關(guān)研究成果“Bioinspired stratified electrowritten fiber-reinforced hydrogel constructs with layer-specific induction capacity for functional osteochondral regeneration”發(fā)表于Biomaterials上。

S\D\B的支架使用熔融近場(chǎng)直寫技術(shù)制造，其中B層不施加電壓，用不同的打印參數(shù)實(shí)現(xiàn)纖維的排列與直徑分布區(qū)別。載細(xì)胞的GelMA水凝膠使用紫外線輔助、逐步滲透并交聯(lián)，如Figure 1。層特異性纖維排列和生長(zhǎng)因子傳遞的聯(lián)合作用使層特異性誘導(dǎo)BMSCs表現(xiàn)出與原生骨軟骨組織相似的分區(qū)細(xì)胞表型和ECM組成。此外，S層的加入可以使再生軟骨具有更潤(rùn)滑和更耐磨的表面，這對(duì)功能性骨軟骨再生至關(guān)重要。

圖1 異質(zhì)復(fù)合結(jié)構(gòu)示意圖

異質(zhì)復(fù)合支架的實(shí)際打印結(jié)果如Figure 2。在PCEC-nHA 支架表面可以觀察到少量分散的HA顆粒，這表明HA納米顆粒已經(jīng)成功地融入到PCEC支架中。此外，載生長(zhǎng)因子的微球和水凝膠中BMP-7、TGF- mik1和BMP-2的累積釋放譜顯示，GFs可以在3周的孵育時(shí)間內(nèi)持續(xù)釋放。

圖2 支架打印結(jié)果，支架力學(xué)與細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)

不同的支架結(jié)構(gòu)在體外構(gòu)建S、D和B層，誘導(dǎo)軟骨形成和成骨相關(guān)的分區(qū)標(biāo)記的差異表達(dá)，結(jié)果如Figure 3。 由于高模量PCEC纖維的增強(qiáng)，本來(lái)弱的GelMA水凝膠得到了增強(qiáng)，其壓縮模量與天然軟骨相當(dāng)。結(jié)果表明mRNA和蛋白表達(dá)水平等級(jí)具有明顯不同，S + G + F組合后的樣品誘導(dǎo)帶顯性標(biāo)記表達(dá)的能力顯著增強(qiáng)。

圖3 不同的支架配方在體外構(gòu)建S、D和B層，誘導(dǎo)軟骨形成和成骨相關(guān)的分區(qū)標(biāo)記的差異表達(dá)

Figure 4顯示了三層S +G + F結(jié)構(gòu)的分區(qū)特異性軟骨形成和成骨相關(guān)標(biāo)記蛋白積累和細(xì)胞F-肌動(dòng)蛋白定向。結(jié)果表明，開發(fā)的三層S + G + F結(jié)構(gòu)可能有希望用于工程空間分層的骨-軟骨組織，具有原生細(xì)胞定向和帶狀標(biāo)記蛋白沉積。

圖4 使用S + G + F構(gòu)建的三層結(jié)構(gòu)使細(xì)胞的空間分層定向和區(qū)域標(biāo)記蛋白在體外積累

研究人員將先前實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)最好的S + G + F組合支架用于兔骨-軟骨缺損模型的修復(fù)，如Figure 5。使用單層B、雙層B + D和三層B + D + S復(fù)合支架進(jìn)行術(shù)后24周缺陷修復(fù)的大體觀察。結(jié)果表明，在缺陷區(qū)域引入S層能夠提供潤(rùn)滑，減輕關(guān)節(jié)磨損，并使再生軟骨具有光滑的表面。所有被測(cè)組在術(shù)后6個(gè)月的缺損區(qū)域顯示出相當(dāng)數(shù)量的鈣化組織。此外，隨著愈合時(shí)間的延長(zhǎng)，可以觀察到骨沉積增強(qiáng)和支架逐漸降解的情況。

圖5 體外造軟骨成骨效果最好的復(fù)合結(jié)構(gòu)組合(S + G + F組合支架)在兔骨-軟骨缺損模型中的研究結(jié)果

綜上，在纖維引導(dǎo)和GF誘導(dǎo)的共同作用下，復(fù)合結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出良好的誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨分化和成骨系分化的能力，并表現(xiàn)出具有空間變化的細(xì)胞表型和ECM組成的帶狀組織三維結(jié)構(gòu)。體內(nèi)軟骨缺損修復(fù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，纖維增強(qiáng)和生長(zhǎng)因子加載的三層水凝膠結(jié)構(gòu)可以同時(shí)促進(jìn)軟骨和軟骨下骨的再生。

論文鏈接：
https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2020.120385